郭 藤，王世平*，曹佳璐

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化新型氨基酸鉻螯合物制備工藝

郭 藤，王世平*，曹佳璐

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

優(yōu)化牛血酶解液復(fù)合氨基酸制備工藝。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法研究溫度、時(shí)間、pH值、質(zhì)量比及各因素的交互作用對(duì)螯合反應(yīng)的影響。模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型，并確定最佳工藝條件為溫度48.9℃、時(shí)間85.57min、pH7.15、質(zhì)量比3.76:1。在此條件下螯合率理論值為0.6135，實(shí)測(cè)值為0.6013，相對(duì)誤差為1.99%，理論值測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間擬合性好。本實(shí)驗(yàn)為開發(fā)新型的補(bǔ)鉻產(chǎn)品和金屬螯合物的研究提供了一定的理論依據(jù)。

血紅蛋白；鉻；螯合物；響應(yīng)面分析

鉻(chromium，Cr)作為動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素之一，主要是通過葡萄糖耐量因子(glucosetolerance factor， GTF)協(xié)同或增強(qiáng)胰島素的作用，進(jìn)而影響糖、脂類、蛋白質(zhì)和核酸代謝。現(xiàn)有研究表明，飼糧中添加有機(jī)鉻對(duì)畜禽的生長(zhǎng)、繁殖、免疫狀態(tài)以及胴體品質(zhì)等均有良好影響。因此對(duì)有機(jī)鉻的開發(fā)、研究已成為熱點(diǎn)[1-5]。

氨基酸微量元素螯合物克服了無機(jī)鹽和有機(jī)鹽的缺點(diǎn)，能顯著的增加動(dòng)物體對(duì)礦物質(zhì)微量元素的吸收，并且無毒、無副作用、無沉積、不損害消化系統(tǒng)、不影響其他微量元素及維生素等營(yíng)養(yǎng)成分的吸收[6-8]。血蛋白屬于完全蛋白質(zhì)，是一種非常理想的蛋白質(zhì)資源，以農(nóng)產(chǎn)品加工廢棄物牛血為原料制備復(fù)合氨基酸鉻螯合物尚未見報(bào)道，這種方法對(duì)于加強(qiáng)我國(guó)動(dòng)物血資源的利用、減少環(huán)境污染和資源浪費(fèi)以及開發(fā)新型的微量元素添加劑具有十分重要的意義，具有很高的研究?jī)r(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景[9-10]。

以往氨基酸微量元素螯合物的制備工藝優(yōu)化多采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到的最佳工藝條件只能是理想條件，無法給出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合的最優(yōu)值，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中不免會(huì)有諸多局限性[11-12]。響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，可用于確定各因素及其交互作用在工藝過程中對(duì)響應(yīng)值的影響，精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表述方面更加優(yōu)良，精確度高，預(yù)測(cè)性好。RSM軟件結(jié)合Graph2等繪圖軟件還能夠給出參數(shù)與響應(yīng)值之間的平面圖和立體圖，直觀地提供局部參數(shù)值和整體響應(yīng)面值之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而獲得明確有用的結(jié)論。

本研究以畜產(chǎn)品加工廢棄物牛血制備氨基酸鉻螯合物，對(duì)生物資源合理利用，減少環(huán)境污染具有重要意義，這方面報(bào)道在國(guó)內(nèi)尚不多見。與以往螯合物制備方法相比，本方法所得螯合物氨基酸含量豐富、易于吸收、得率較高、成本低[13-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛血 御香苑食品有限公司；中性蛋白酶、Flavourzyme 諾維信公司；三氯化鉻 北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-BA型水浴振蕩器 金壇榮華儀器制造有限公司；TDL-5A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FE20型酸度計(jì) Mettler Toledo公司；UV-5200紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛血血紅蛋白酶解液的制備

新鮮牛血血液→分離血紅蛋白→加中性蛋白酶和Flavourzyme水解(控制反應(yīng)條件)→沸水浴或高壓滅酶同時(shí)消毒滅菌(15min)→離心(4000r/min，5min)→酶解液[15]

1.3.2 牛血血紅蛋白酶解液鉻螯合物的制備

牛血血紅蛋白酶解液→預(yù)熱→加CrCl3·6H2O→調(diào)節(jié)pH值→恒溫水浴振蕩→無水乙醇提取→離心取沉淀→冷凍干燥得螯合物

1.3.3 螯合率測(cè)定

準(zhǔn)確移取牛血血紅蛋白酶解液鉻反應(yīng)液1mL于50mL容量瓶中，定容，搖勻，二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定總鉻含量[16-17]。另移取牛血血紅蛋白酶解液鉻反映液1mL于50mL離心管中，加入20mL無水乙醇提取，離心分離，將沉淀用水溶解，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，定容，搖勻，二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定鉻含量。

式中：M1是所測(cè)的1mL反應(yīng)液中總鉻的含量；M2是測(cè)得1mL反應(yīng)液提取的螯合物里鉻含量。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

分別以不同的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH值、質(zhì)量比(牛血酶解液蛋白含量:鉻)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各單因素對(duì)螯合率的影響，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.5 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)

利用Design-expert 7.1.6統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用四因素三水平旋轉(zhuǎn)通用中心組合設(shè)計(jì)，以反應(yīng)溫度(x1)、時(shí)間(x2)、pH值(x3)、質(zhì)量比(x4)為變量，螯合率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定中心組合試驗(yàn)因素與水平。各因素的水平編碼表見表1。

表1 因素及水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)固定其他3個(gè)因素，單獨(dú)考察另外一個(gè)因素對(duì)螯合率的影響時(shí)，結(jié)果表明：反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合率影響不大，質(zhì)量比越大螯合率就越高，而螯合率隨反應(yīng)溫度和pH值的增大呈先增加后降低趨勢(shì)。螯合率最大時(shí)，反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH值、質(zhì)量比分別為50℃、90min、pH7.0、3:1。并以此為0水平，確定中心組和水平，設(shè)計(jì)四元三次通用旋轉(zhuǎn)組合正交試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化反應(yīng)條件

2.2.1 螯合反應(yīng)二次多項(xiàng)式回歸方程建立及方差分析

試驗(yàn)按四因素三水平實(shí)施，中心點(diǎn)重復(fù)7次，共31個(gè)處理，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

利用Design-expert 7.1.6統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行回歸分析，牛血血紅蛋白酶解液與Cr3+螯合反映的模型：Y= 0.629071-0.0114542X1-0.00500417X2＋0.00377917X3-0.0117375X4-0.0248376X12＋0.0151062X1X2＋0.00243125X1X3-0.0159438X1X4-0.00985015X22-0.00485625X2X3-0.00545625X2X4-0.0266501X32-0.00030625X3X4-0.0185501X42。

牛血血紅蛋白酶解液與Cr3+螯合反應(yīng)的四元三次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的方差分析見表3。由表3可得，該數(shù)學(xué)模型顯著性檢驗(yàn)F值為5.88，(P=0.0006＜0.01)，達(dá)到了極顯著水平。反映出該方程式在試驗(yàn)點(diǎn)上與試驗(yàn)結(jié)果相吻合。失擬性檢驗(yàn)F值為3.1，(P=0.0898＞0.05)，差異不顯著，表明回歸方程無失擬因素存在，回歸方程擬合得較好，可以用該方程預(yù)測(cè)牛血酶解液與Cr3+的螯合反應(yīng)。對(duì)模型中各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，在α=0.05顯著水平剔除不顯著項(xiàng)后，簡(jiǎn)化后的回歸方程：Y=0.629071＋0.00377917X3-0.0117375X4-0.0248376X12＋0.00243125X1X3-0.0159438X1X4-0.0266501X32-0.0185501X42。

表2 牛血血紅蛋白酶解液與Cr3+螯合反應(yīng)的四元三次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design and results of central composite rotation experiments

表3 牛血血紅蛋白酶解液與Cr3+螯合反應(yīng)的四元三次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方差分析表Table 3 Variance analysis of central composite experiments

從因素分析可知，在試驗(yàn)條件下，反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH值以及質(zhì)量比等4個(gè)因素對(duì)螯合率的影響大小依次為質(zhì)量比＞pH值＞溫度＞時(shí)間。模型方程的某些一次項(xiàng)和交互項(xiàng)的影響顯著，而二次項(xiàng)極顯著，說明各個(gè)具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，這將在各影響因素的交互作用中進(jìn)行分析。

2.2.2 各影響因素的交互作用分析

2.2.2.1 溫度和質(zhì)量比交互作用對(duì)螯合反應(yīng)的影響

由表3可知，溫度和質(zhì)量比交互作用對(duì)牛血血紅蛋白酶解液與Cr3+螯合反應(yīng)的影響顯著。采用降維分析法，將回歸模型中時(shí)間和pH值固定在零水平，即可得到溫度和質(zhì)量比對(duì)螯合率的回歸方程：Y= 0.629071-0.0117375X4-0.0248376X12-0.0159438X1X4-0.0185501X42。利用Designexpert 7.1.6統(tǒng)計(jì)分析軟件繪制溫度和質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)交互影響的3D曲線和等高線圖，如圖1所示。

圖1 反應(yīng)溫度和質(zhì)量比交互作用的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between reaction temperature and hydrolysate-chromium ratio on chelating rate

由圖1可知，在所選的范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面的最高點(diǎn)，同時(shí)也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)。溫度和質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響呈負(fù)二次曲線，當(dāng)質(zhì)量比和溫度兩個(gè)因素同時(shí)變化時(shí)，隨著二者的增加，螯合率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。這是由于Cr3+加入量是固定的，質(zhì)量比越大反應(yīng)體系中配體數(shù)目越多，有利于反應(yīng)平衡向反應(yīng)物生成方向移動(dòng)，但隨著溫度超過50℃，牛血酶解液中的小肽和氨基酸變性，螯合率降低。沿質(zhì)量比變化方向，等高線較密集，而沿溫度變化方向等高線稀疏，說明質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)的影響比溫度顯著，與表3所得結(jié)論一致。

2.2.2.2 溫度和pH值交互作用對(duì)螯合反應(yīng)的影響

由表3可知，溫度和pH值的交互作用對(duì)牛血血紅蛋白酶解液與Cr3+螯合反應(yīng)的影響為顯著水平。采用降維分析法，將回歸模型中時(shí)間和質(zhì)量比固定在零水平，即可得到溫度和pH值對(duì)螯合率的回歸方程：Y=0.629071＋0.00377917X3-0.0248376X12＋0.00243125X1X3-0 .0266501X32。利用Design-expert 7.1.6統(tǒng)計(jì)分析軟件繪制溫度和pH值對(duì)螯合反應(yīng)交互影響的3D曲線和等高線圖，如圖2所示。

圖2 反應(yīng)溫度和pH值交互作用的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between reaction temperature and pH on chelating rate

由圖2可知，在所選的范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面的最高點(diǎn)，同時(shí)也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)。其對(duì)應(yīng)溫度在48～50℃之間，對(duì)應(yīng)pH值在7.0～7.2之間。溫度和pH值對(duì)螯合率的影響呈負(fù)二次曲線，在酸性和低溫度范圍內(nèi)，隨著pH值和溫度增加螯合率呈上升趨勢(shì)，因?yàn)樵趐H值較低的酸性條件下，存在大量氫離子與鉻離子爭(zhēng)奪供電子基團(tuán)，不利于螯合物的形成；在堿性和高溫度范圍內(nèi)，隨著pH值和溫度增加螯合率降低，因?yàn)樵趐H值較高的堿性條件下，羥基易與鉻離子形成氫氧化鉻沉淀[18]。且溫度升高到一定程度會(huì)使小肽和氨基酸變性，無法與鉻離子結(jié)合生成螯合物。從等高線圖還可以看出，沿pH值軸向等高線較密集，而沿溫度軸向等高線較稀疏，說明質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)得影響比溫度顯著，與表3所得結(jié)論一致。

2.2.2.3 溫度和時(shí)間交互作用對(duì)螯合反應(yīng)的影響

由表3可知，溫度和時(shí)間交互作用對(duì)牛血血紅蛋白酶解液與Cr3+螯合反應(yīng)的影響不顯著。利用Design-expert 7.1.6統(tǒng)計(jì)分析軟件繪制溫度和時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)交互影響的3D曲線和等高線圖，如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度和時(shí)間之間交互作用的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between reaction temperature and reaction time on chelating rate

由圖3可知，在所選的范圍內(nèi)不存在極值，溫度對(duì)螯合率的影響呈負(fù)二次曲線，而時(shí)間對(duì)螯合率的影響呈一次線性關(guān)系。即使在較低溫度下，螯合率也比較高且隨時(shí)間變化不大，但超過一定溫度范圍，致使小肽和氨基酸變性，螯合率顯著下降。因此可知，牛血酶解液與鉻的螯合反應(yīng)為可在常溫下進(jìn)行的較為快速的反應(yīng)。從等高線圖還可看出，螯合率隨溫度和時(shí)間的變化幅度很小，即受二者影響不顯著。沿溫度軸向等高線較密集，而沿時(shí)間軸向等高線較稀疏，說明溫度對(duì)螯合反應(yīng)得影響比時(shí)間顯著，與表3所得結(jié)論一致。

2.2.2.4 時(shí)間與質(zhì)量比交互作用對(duì)螯合反應(yīng)的影響

由表3可知，質(zhì)量比和時(shí)間交互作用對(duì)牛血血紅蛋白酶解液與Cr3+螯合反應(yīng)的影響不顯著。利用Designexpert 7.1.6統(tǒng)計(jì)分析軟件繪制質(zhì)量比和時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)交互影響的3D曲線和等高線圖，如圖4所示。

由圖4可知，在所選的范圍內(nèi)不存在極值，質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響呈負(fù)二次曲線，而時(shí)間對(duì)螯合率的影響呈一次線性關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量比和時(shí)間同時(shí)變化時(shí)，隨著二者的增加，螯合率呈上升趨勢(shì)；且螯合率隨時(shí)間變化不大，隨質(zhì)量比增加而增加。其等高線呈圓形，說明其交互作用不顯著，沿質(zhì)量比軸向等高線較密集，而沿時(shí)間軸向等高線較稀疏，說明質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)得影響比時(shí)間顯著，與表3所得結(jié)論一致。

圖4 反應(yīng)時(shí)間和質(zhì)量比交互作用的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between reaction time and hydrolysate-chromium ratio on chelating rate

2.2.2.5 時(shí)間與pH值交互作用對(duì)螯合反應(yīng)的影響

圖5 pH值和溫度交互作用的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between pH and reaction time on chelating rate

由表3可知，pH值和時(shí)間交互作用對(duì)牛血血紅蛋白酶解液與Cr3+螯合反應(yīng)的影響不顯著。利用Designexpert 7.1.6統(tǒng)計(jì)分析軟件繪制時(shí)間和pH值對(duì)螯合反應(yīng)交互影響的3D曲線和等高線圖，如圖5所示。

由圖5可知，在所選的范圍內(nèi)不存在極值，pH值對(duì)螯合率的影響呈負(fù)二次曲線，而時(shí)間對(duì)螯合率的影響呈一次線性關(guān)系。螯合率隨pH值增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，這是由于，在pH值較低的酸性條件下，存在大量氫離子與鉻離子爭(zhēng)奪供電子基團(tuán)，不利于螯合物的形成；在pH值較高的堿性條件下，氫氧根離子易與鉻離子形成氫氧化鉻沉淀；而隨時(shí)間的變化不顯著。從等高線圖還可以看出，沿pH值軸向等高線密集，而沿時(shí)間軸向等高線稀疏，說明pH值對(duì)螯合反應(yīng)得影響比時(shí)間顯著，與表3所得結(jié)論一致。

2.2.2.6pH值與質(zhì)量比交互作用對(duì)螯合反應(yīng)的影響

由表3可知，pH值和質(zhì)量比交互作用對(duì)牛血血紅蛋白酶解液與Cr3+螯合反應(yīng)的影響不顯著。利用Designexpert 7.1.6統(tǒng)計(jì)分析軟件繪制pH值和質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)交互影響的3D曲線和等高線圖，如圖6所示。

圖6 pH值和質(zhì)量比交互作用的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between pH and hydrolysate-chromium ratio on chelating rate

由圖6可知，在所選的范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面的最高點(diǎn)，同時(shí)也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)。質(zhì)量比和pH值對(duì)螯合率的影響呈負(fù)二次曲線。在酸性范圍內(nèi)，隨著pH值和質(zhì)量比增加螯合率呈上升趨勢(shì)，這是由于在pH值較低的酸性條件下，存在大量氫離子與鉻離子爭(zhēng)奪供電子基團(tuán)，不利于螯合物的形成；在堿性和高溫度范圍內(nèi)，隨著pH值和質(zhì)量比增加螯合率降低，這是由于在pH值較高的堿性條件下，氫氧根離子易與鉻離子形成氫氧化鉻沉淀。其等高線呈圓形，說明二者相互作用不顯著。

2.2.3 利用回歸方程確定最佳工藝及驗(yàn)證

利用得到的回歸方程，分別對(duì)X1、X2、X3、X4求偏階導(dǎo)數(shù)，并令其偏導(dǎo)等于零，得到下面的四元一次方程組[19]：

解此線性方程組得：X1=-0.1037，X2=-0.1478，X3=0.1505，X4=0.7629。即牛血酶解液與鉻螯合反映的最佳工藝條件：溫度為48.9℃、時(shí)間為85.57min、pH7.15、質(zhì)量比為3.76。在此條件下，螯合率理論最大值為0.6135。對(duì)優(yōu)化工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，3次重復(fù)，實(shí)際測(cè)得的螯合率為0.6013，與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差在1.99%左右。

3 結(jié) 論

3.1 利用Design-expert 7.0軟件響應(yīng)曲面法，建立了螯合率的二次多項(xiàng)式回歸模型方程：Y= 0.629071＋0.00377917X3-0.0117375X4-0.0248376X12＋0.00243125X1X3-0.0159438X1X4-0.0266501X32-0.0185501X42?；貧w方程擬合得較好，可以用該方程預(yù)測(cè)牛血酶解液與Cr3+的螯合反應(yīng)。

3.2 同時(shí)利用模型的響應(yīng)曲面對(duì)影響螯合率的各因素進(jìn)行分析。結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)螯合率的影響大小依次：質(zhì)量比＞pH值＞溫度＞時(shí)間。且溫度和質(zhì)量比、溫度和pH值之間的交互作用顯著。

3.3 通過計(jì)算與驗(yàn)證得到牛血酶解液與鉻螯合最優(yōu)工藝條件：溫度48.9℃、時(shí)間85.57min、pH7.15、質(zhì)量比3.76。在此條件下，螯合率理論值0.6135，實(shí)測(cè)值0.6013，相對(duì)誤差為1.99%，測(cè)值與實(shí)際值之間擬合性好。

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Optimization of Preparation Processing for Chromium Amino Acid Chelated by Response Surface Analysis

GUO Teng，WANG Shi-ping*，CAO Jia-lu
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

In order to optimize the preparation processing of chromium amino acid chelated, response surface methodology was employed to analyze the effects of reaction temperature, reaction time, pH, protein hydrolysate-chromium ratio and the cross-interaction among factors on chelating reaction. On the basis of single-factor experimental results, a mathematical regression model was established, and the optimal preparation processing conditions were reaction temperature of 48.9 ℃, reaction time of 85.57 min, pH 7.15, protein hydrolysate-chromium ratio of 3.76:1. Under these optimal processing conditions, the chelating rate was 0.6013, which was close to theoretical chelating rate of 0.6135 with a relative error of 1.99%. Therefore, this investigation provided a theoretical reference for the chromium supplementary products.

haemoglobin；chromium；chelate；response surface analysis

TS251.93

A

1002-6630(2010)24-0186-06

2010-01-30

郭藤(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品安全。E-mail：twfyfe@163.com

*通信作者：王世平(1959—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品安全。E-mail：wang744447@163.com