林曉麗，饒 輝，熊勇華，陳 媛，劉文娟，賴衛(wèi)華,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西 南昌 330029；3.江西中德生物工程有限公司，江西 南昌 330029)

膠體金試紙條快速檢測食品中磺胺二甲基嘧啶殘留

林曉麗1，饒 輝2，熊勇華1，陳 媛3，劉文娟3，賴衛(wèi)華1,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西 南昌 330029；3.江西中德生物工程有限公司，江西 南昌 330029)

目的：旨在建立一種快速、簡便的針對磺胺二甲基嘧啶殘留的檢測方法。方法：應(yīng)用競爭抑制免疫層析原理，研制磺胺二甲基嘧啶膠體金試紙條。結(jié)果：該試紙條檢測限為10ng/mL、檢測時(shí)間5min，與其他磺胺類藥物交叉反應(yīng)小，可用于多種食品樣本的檢測，且樣本檢測限為100μg/kg。結(jié)論：該方法操作簡便、靈敏度高且特異性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)對食品樣品中磺胺二甲基嘧啶殘留的快速檢測。

磺胺二甲基嘧啶；膠體金；試紙條；快速檢測

磺胺二甲基嘧啶作為一種廣譜抑菌劑，具有穩(wěn)定性好、口服易吸收且價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，常被用于預(yù)防和控制畜禽疾病[1]。食品中磺胺二甲基嘧啶的殘留直接影響甚至威脅到消費(fèi)者的健康。我國規(guī)定了畜禽產(chǎn)品中磺胺二甲基嘧啶的最高殘留限量為100μg/kg[2]，歐盟也對磺胺類藥物在畜禽產(chǎn)品中的殘留作出了嚴(yán)格的規(guī)定[3]。目前，磺胺類藥物的殘留檢測方法主要有酶聯(lián)免疫方法(ELISA)[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5]、氣質(zhì)聯(lián)用法(GCMS)[6]、液質(zhì)聯(lián)用法(HPLC-MS)[7]等，但這些方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，不適于快速、簡便地進(jìn)行大批量樣品的檢測。本研究基于膠體金免疫層析技術(shù)，擬研制出從組織樣本、蜂蜜、蛋類中快速檢測磺胺二甲基嘧啶殘留的膠體金試紙條。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BALB/c小鼠(6周齡，雄性) 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；蛋類、蜂蜜、牛肉 江西省南昌市農(nóng)產(chǎn)品檢測中心；豬肉、雞肉 江西省獸藥飼料監(jiān)察所；魚肉、蝦肉 江西省水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心。

磺胺二甲基嘧啶(SM2)、PEG20000、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑 Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)北京新經(jīng)科生物公司；氯金酸(HAuCl4) 天津市福晨化學(xué)試劑廠；檸檬酸三鈉 北京化工試劑公司；硝酸纖維膜(NC膜)、膠金墊、樣品墊、濾紙、吸水紙及PVC底板 Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XYZ3000型三維噴點(diǎn)平臺(tái)、試紙條切割機(jī) Biodot公司；除濕機(jī) 日本川井公司；真空干燥機(jī) 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；包裝機(jī) 豐興包裝機(jī)械材料有限公司；磁力攪拌加熱器 江蘇金壇市金城國盛實(shí)驗(yàn)儀器廠；高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器總廠；紫外-可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.3.1 人工抗原的制備

利用重氮法合成SM2與BSA的偶聯(lián)物[8]，具體方法如下：用0.2mol/L NaOH溶液溶解5mg SM2，加入NaNO2溶液混勻，避光攪拌，將混合液逐滴加入到已預(yù)冷的0.2mol/L HCl溶液中，4℃避光反應(yīng)3h，得重氮化SM2；稱取適量的BSA溶于PBS中，預(yù)冷后邊攪拌邊逐滴加入重氮化SM2中，調(diào)pH8.0，4℃避光反應(yīng)過夜；反應(yīng)產(chǎn)物用PBS透析3d，得到純化的SM2-BSA。

1.3.2 單克隆抗體的制備

將SM2-BSA偶聯(lián)物免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/O小鼠骨髓細(xì)胞融合，融合細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)7～14d，采用間接競爭ELISA方法篩選分泌抗體的雜交細(xì)胞株，雜交細(xì)胞株進(jìn)行三次克隆化，將克隆細(xì)胞株注入小鼠腹腔產(chǎn)生腹水。所得腹水用辛酸硫酸銨法純化后，加等體積甘油，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 膠體金的制備[9]

在1L圓底燒瓶中加入500mL 0.01g/100mL HAuCl4溶液，加熱煮沸后立即加入1g/100mL檸檬酸三鈉溶液，溶液顏色由淺黃變?yōu)樗{(lán)色，藍(lán)色逐漸加深，最后變?yōu)榧t色；當(dāng)溶液顏色完全變?yōu)橥该鞯募t色時(shí)，繼續(xù)回流10min后停止加熱，冷卻至室溫。

1.3.4 金標(biāo)抗體的制備

取膠體金至干凈燒杯中，用0.2mol/L K2CO3溶液將pH值調(diào)至7.0，室溫條件下邊攪拌邊逐滴加入抗SM2-Ab，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1h后，按1/10體積逐滴加入10g/100mL BSA，攪拌反應(yīng)30min；5000r/min離心30min，小心吸去上清液，加入重懸液，得到抗SM2金標(biāo)抗體。

1.3.5 試紙條的組裝

用三維噴點(diǎn)平臺(tái)將SM2-BSA和驢抗鼠二抗噴在NC膜上，分別作為檢測T線與質(zhì)控C線，30℃干燥箱干燥過夜；同時(shí)將抗SM2金標(biāo)抗體噴在膠金墊上，30℃真空干燥1.5h；將NC膜、膠金墊、樣品墊、濾紙、吸水紙及PVC底板組裝好后，切成4mm寬后裝卡，置于錫箔袋中，加干燥劑密封，于4～30℃保存。

1.3.6 檢測方法

將試紙條平放，往樣本池中加入80μL樣本，反應(yīng)5min即可判讀結(jié)果。當(dāng)樣品中SM2質(zhì)量濃度大于10ng/mL時(shí)，則質(zhì)控C線顯色且檢測T線不出現(xiàn)條帶，結(jié)果為陽性；當(dāng)樣品中SM2質(zhì)量濃度小于10ng/mL時(shí)，質(zhì)控C線顯色且檢測T線出現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果為陰性；若質(zhì)控C線不顯色，說明操作不當(dāng)或者試紙條失效。

1.3.7 樣本前處理方法[10-12]

組織樣本的處理：取切碎的組織樣本于均質(zhì)機(jī)以10000r/min均質(zhì)1min；稱取1.0g均質(zhì)物置于離心管中，加入4mL乙腈，渦旋振蕩5min；室溫條件下4000r/min離心5min，移取1.25mL上清液至另一新離心管中，55℃條件下氮?dú)獯蹈桑幌驓埩粑镏屑尤?mL正己烷，渦動(dòng)30s，再加入1mL磷酸鹽緩沖液，振蕩1min；室溫條件下4000r/min離心10min，取下層液相，用磷酸鹽緩沖液稀釋4倍后檢測。

蜂蜜樣本的處理：稱取1.0g均質(zhì)物置于離心管中，加入4mL乙腈，渦旋振蕩5min；室溫下4000r/min離心5min，移取1.25mL上清液至另一新離心管中，55℃條件下氮?dú)獯蹈?；往殘留物中加?mL正己烷，振蕩30s，再加入1mL磷酸鹽緩沖液，渦動(dòng)1min；室溫條件下4000r/min離心10min，取下層液相，用磷酸鹽緩沖液稀釋4倍后檢測。

蛋類樣本的處理：蛋類樣本去殼后，用均質(zhì)機(jī)500r/min勻漿20s，使蛋清和蛋黃充分混合；稱取1.0g均質(zhì)物置于離心管中，加入5mL磷酸鹽緩沖液，手動(dòng)輕搖20min，避免乳化；室溫條件下4000r/min離心10min，取上清液用磷酸鹽緩沖液稀釋4倍后檢測。

1.4 評價(jià)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 靈敏度

將SM2標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成5、8、10、15、20、50、100ng/mL，另設(shè)陰性對照，用試紙條進(jìn)行檢測。分別從3個(gè)不同批次隨機(jī)抽取試紙條，每組做兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果判斷試紙條靈敏度。

1.4.2 樣本檢測限

對豬肉、雞肉、牛肉、魚肉、蝦肉、蜂蜜、雞蛋共7種陰性樣本添加SM2標(biāo)準(zhǔn)品，添加量分別為25、50、100、200ng/g，另設(shè)陰性對照，按1.3.7節(jié)所述方法對樣品進(jìn)行處理，用試紙條進(jìn)行多次重復(fù)檢測，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定樣本檢測限。

1.4.3 特異性

將磺胺甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺甲噁唑8種磺胺藥物分別稀釋成10、100、1000、10000ng/mL后用試紙條檢測。不同樣本每個(gè)濃度做多次重復(fù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定試紙條的特異性。

1.4.4 重復(fù)實(shí)驗(yàn)

分別從3個(gè)批次中隨機(jī)抽取試紙條，對陰性及10ng/mL SM2標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行多次重復(fù)測定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定試紙條的重復(fù)性。

1.4.5 加速保存實(shí)驗(yàn)

將密封好的試紙條置于60℃保存，每隔3d用其對陰性及10ng/mL SM2標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行多次重復(fù)測定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定試紙條的保質(zhì)期。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的合成

采用重氮法進(jìn)行半抗原偶聯(lián)，所得產(chǎn)物經(jīng)紫外光譜分析，SM2-BSA偶聯(lián)比為1:30；同時(shí)采用間接競爭ELISA法驗(yàn)證SM2與BSA是否偶聯(lián)成功，結(jié)果表明隨著人工抗原含量的降低，SM2標(biāo)準(zhǔn)品對其的抑制率會(huì)升高，即人工抗原與SM2標(biāo)準(zhǔn)品能競爭結(jié)合SM2抗體，證明抗原偶聯(lián)成功。

2.2 試紙條條件的確定

通過對抗體標(biāo)金量、抗體標(biāo)記pH值、SM2-BSA的濃度、抗SM2金標(biāo)抗體的包被量等條件進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)及調(diào)整，最終確定最佳條件為抗體標(biāo)金量為1.0μg/mL、抗體標(biāo)記pH7.0、抗SM2金標(biāo)抗體的包被量為10μL/cm、SM2-BSA使用質(zhì)量濃度為0.5mg/mL(噴量為0.74μL/cm)，質(zhì)控線驢抗鼠IgG使用濃度為1.0mg/mL(噴量為0.74μ L/cm)。

2.3 靈敏度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，該試紙條檢測含量在10ng/mL以上的SM2標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，結(jié)果為陽性；檢測含量在10ng/mL以下的SM2標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，結(jié)果為陰性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定該試紙條的靈敏度為10ng/mL。

2.4 特異性對選取的8種磺胺類似物進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該試紙條特異性強(qiáng)。在0～10000ng/mL范圍內(nèi)，與大多數(shù)磺胺類似物無交叉反應(yīng)，僅與磺胺甲基嘧啶、磺胺嘧啶有一定的交叉反應(yīng)。

表1 磺胺二甲基嘧啶快速檢測試紙條的靈敏度Table 1 Sensitivity of rapid test strip for sulfadimidine

2.5 樣本檢測限

表2 磺胺二甲基嘧啶快速檢測試紙條與其他磺胺類藥物的交叉反應(yīng)Table 2 Cross-reactivity of sulfadimidine rapid test strip with other sulfonamides

經(jīng)測定，豬肉、雞肉、牛肉、魚肉、蝦肉、蜂蜜、雞蛋共7種陰性樣本中SM2加標(biāo)量為100ng/g時(shí)，檢測T線不顯色，結(jié)果判為陽性。檢測結(jié)果如圖2所示，根據(jù)結(jié)果判定該試紙條對組織樣本、蜂蜜及雞蛋中SM2的實(shí)際檢測限為100μg/kg。

2.6 重復(fù)實(shí)驗(yàn)

圖1 對7種樣本的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Determination of sulfadimidine in seven spiked samples

多次重復(fù)測定結(jié)果一致，表明該試紙條批內(nèi)、批間測定差異小，重復(fù)性良好。

2.7 加速保存實(shí)驗(yàn)

該試紙條于60℃可保質(zhì)12d。膠體金免疫層析試紙條60℃穩(wěn)定1d相當(dāng)于常溫保質(zhì)一個(gè)半月，以此類推，SM2試紙條在常溫干燥環(huán)境下保質(zhì)期超過12個(gè)月。

3 討 論

本研究成功研制出了磺胺二甲基嘧啶快速檢測試紙條。該試紙條應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)[13]：樣本中的磺胺二甲基嘧啶在流動(dòng)的過程中與膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合，從而抑制抗體和NC膜檢測線上SM2-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，原理圖詳見圖3。

圖2 磺胺二甲基嘧啶快速檢測試紙條作用原理圖Fig.2 Principle of sulfadimidine rapid test strip

該試紙條可適用于多種食品樣品的檢測，其靈敏度達(dá)10ng/mL，樣本實(shí)際檢測限為100μg/kg，能滿足我國及歐盟等國對磺胺二甲基嘧啶最高殘留限量的要求。該檢測方法整個(gè)過程只需一步加樣，反應(yīng)5min即可判讀結(jié)果，而且具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、易于判定、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，適合于大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測。

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Rapid Detection of Sulfadimidine Residue in Food by Colloidal Gold Strips

LIN Xiao-li1，RAO Hui2，XIONG Yong-hua1，CHEN Yuan3，LIU Wen-juan3，LAI Wei-hua1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Jiangxi Provincial Institute of Veterinary Drug and Feed Control, Nanchang 330029, China；3. Jiangxi Zodolabs Biological Engineering Co. Ltd., Nanchang 330029, China )

Objective: To establish a rapid and convenient detection method for sulfadimidine residue in food. Methods: The colloidal gold strip for specific sulfadimidine was developed successfully on the basis of competitive inhibition immunochromatography mechanism. Results: The detection limit of the colloidal gold strip was 10 ng/mL for sulfadimidine within less than 5 min, which also had low cross-reactivity with other sulfonamides. The colloidal gold strip could be used in rapid detection of sulfadimidine residue in many kinds of food samples with detection limit of 100 μg/kg. Conclusion: This method is characteristics of simplicity, high sensitivity and specificity to achieve the rapid detection of sulfadimidine residue in food.

sulfadimidine；colloidal gold；strip；rapid detection

TS207.7

A

1002-6630(2010)24-0366-04

2010-08-02

教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”資助項(xiàng)目(IRT0540)；南昌市重大產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(2009)

林曉麗(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：fub5@163.com

賴衛(wèi)華(1968—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：talktolaiwh@163.com