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        基質(zhì)固相分散術(shù)-UPLC法檢測禽蛋中對位紅和蘇丹紅

        2010-10-28 07:07:14侯曉林孫英健吳國娟吳永寧
        食品科學(xué) 2010年24期

        侯曉林,孫英健,吳國娟,苗 虹,吳永寧

        (1.北京農(nóng)學(xué)院動物科技系,北京 102206;2.中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所,北京 100050)

        基質(zhì)固相分散術(shù)-UPLC法檢測禽蛋中對位紅和蘇丹紅

        侯曉林1,孫英健1,吳國娟1,苗 虹2,吳永寧2

        (1.北京農(nóng)學(xué)院動物科技系,北京 102206;2.中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所,北京 100050)

        建立禽蛋中對位紅和蘇丹紅Ⅰ~Ⅳ號5種色素的液相色譜檢測方法。采用基質(zhì)固相分散術(shù),以氧化鋁作基質(zhì)分散基體,混合均勻的樣品用正己烷-丙酮(99.5:0.5,V/V)直接洗脫,吹干后定容測定,外標(biāo)法定量。5種色素的平均回收率為63.8%~96.2%,平均變異系數(shù)為0.52%~10.07%,檢測限為0.01~0.02mg/kg。在檢測的100個樣品中,1例檢出蘇丹紅Ⅳ號。

        禽蛋;對位紅;蘇丹紅;高效液相色譜;基質(zhì)固相分散

        蘇丹紅(sudan dyes)是一類人工合成的偶氮類、油溶性的化工染料,廣泛用于溶劑、油、蠟和汽油的增色以及鞋、地板的增光,蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ已被國際癌癥研究機構(gòu)列為三類致癌物之一[1-2],禁止作為色素添加劑在食品和飼料中使用,而其殘留在動物體內(nèi)對食用者的健康和生命安全都存在潛在危害。對位紅化學(xué)結(jié)構(gòu)與蘇丹紅相似,具有相似毒性。對于該類化合物的檢測,主要檢測方法有液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法[3-22]和氣相色譜法[5]。提取凈化方法集中于液相萃取和固相萃取。禽蛋及其制品黏性大,不易分散,利用國標(biāo)[3]或傳統(tǒng)有機溶劑萃取[4-22],提取效率較低,往往需要耗費大量溶劑來提高回收率。

        基質(zhì)固相分散基本操作是將樣品(固態(tài)或液態(tài))直接與固相萃取材料一起混合研磨,使樣品均勻分散于固定相顆粒的表面,形成一個獨特的色譜固定相,將其裝柱后依靠所選定的溶劑洗脫樣品。它集合了傳統(tǒng)樣品的均質(zhì)、組織細胞裂解、提取、過濾、凈化等過程,使樣品的預(yù)處理變得簡便,同時也避免了目標(biāo)物的損失。由于該方法具有簡便、樣品和溶劑用量少等優(yōu)點而受到關(guān)注。本實驗采用基質(zhì)固相分散術(shù)提取和凈化禽蛋中的蘇丹紅,UPLC對其進行測定,旨在為其鑒定方法的建立提供一定的參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        對位紅及蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標(biāo)準品 Sigma-Aldrich公司;乙腈、甲醇為色譜純;水為新制的雙蒸水;中性氧化鋁(100~200目) 上?;瘜W(xué)試劑公司,使用前120℃烘干3h,然后置于干燥器內(nèi)待用。

        1.2 儀器與設(shè)備

        超高效液相色譜UPLC-AQUITY系統(tǒng)(配備自動進樣器,二元泵和二極管陣列檢測器) Waters公司。

        1.3 方法

        1.3.1 標(biāo)準貯備溶液配制

        分別稱取對位紅、蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ及蘇丹紅Ⅳ各10.0mg(按實際含量折算),用氯仿溶解并定容至10mL。

        1.3.2 色譜條件

        色譜儀:Waters ACQUITY UPLC配備Photodiode Array(PDA)檢測器。色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm,1.7μm)。流動相:乙腈-水(80:20,V/V)。流速0.4mL/min、柱溫35℃、檢測波長500nm、進樣體積5μL。

        1.3.3 樣品處理

        稱取2g氧化鋁置研缽中,稱取0.5g蛋黃置于氧化鋁上,將氧化鋁和蛋黃充分研磨混合成均勻的粉狀。后裝入5mL空注射器中,然后用35mL丙酮-正己烷(0.5:99.5,V/V)混合溶劑洗脫,收集洗脫液,并于45℃條件氮吹濃縮至近干。用乙酸-乙腈(1:1000,V/V)將殘渣重新溶解并定容至1mL,過0.25μm微孔濾膜,濾液供色譜分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 樣品處理條件的選擇

        2.1.1 萃取條件的選擇

        由于禽蛋中蛋白質(zhì)的含量較多,用直接的液液萃取方法提取時不能有效地分散樣品,表面的一層蛋白質(zhì)先變性后會將樣品中心的色素包裹起來,即使通過振蕩等手段也很難將包被層破壞,因此不能充分地提取樣品。采用乙腈、正己烷和氯仿萃取的回收率均較低,有的甚至低于60%。因此,本實驗針對蛋類食品的特點,選用了基質(zhì)固相分散技術(shù),用氧化鋁與樣品一起研磨,達到均勻后再裝柱、洗脫。這樣能使樣品與氧化鋁,以及洗脫溶劑充分接觸,從而達到很好的提取效率。

        2.1.2 洗脫劑種類的選擇

        稱取10份空白樣品,添加100μg/kg的蘇丹紅混合標(biāo)準工作液,分別用乙腈、三氯甲烷、丙酮正己烷作洗脫劑進行洗脫。實驗結(jié)果表明:氧化鋁對上述5種色素的結(jié)合不緊密,即使用正己烷淋洗,各色素均有洗脫。因此,本實驗條件下,省略了淋洗凈化步驟,采用洗脫劑對各色素直接洗脫。

        實驗發(fā)現(xiàn)完全用正己烷洗脫,對位紅的回收率較低,即使將洗脫體積增加至40mL,回收率一般在40%~50%左右。因此,采用丙酮-正己烷(0.5:99.5,V/V)混合液進行洗脫,5種色素的回收率均比較滿意。因此本研究初步確定用正己烷和丙酮的混合溶劑作為洗脫液。

        2.1.3 洗脫劑體積的優(yōu)化

        為了確保5種蘇丹紅類染料能全部洗脫下來,提高禽蛋中蘇丹紅染料的添加水平(200μg/kg),采用丙酮-正己烷(0.5:99.5,V/V)洗脫,收集洗脫液,每5mL洗脫液收集,累計到35mL。結(jié)果表明,收集的洗脫液總量在35mL以后,洗脫液中不再檢出待測物。故洗脫劑用量確定為35mL。

        2.2 校正曲線和線性范圍

        取1.3.1節(jié)配制的標(biāo)準貯備液分別用乙腈稀釋,配制成質(zhì)量濃度為0.025、0.05、0.10、0.20、0.40μg/mL的混合標(biāo)準溶液,進液相色譜儀,測定標(biāo)準曲線及相關(guān)系數(shù),如表2所示。所有相關(guān)系數(shù)均大于0.995,表明在0.025~0.40μg/mL質(zhì)量濃度范圍,5種色素的響應(yīng)具有很好的線性相關(guān)性(表1)。5種色素的濃度與色譜峰面積呈良好線性關(guān)系,以3倍信噪比為檢出限(LOD),計算得出對位紅、蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的檢出限分別為0.01~0.02mg/kg。以10倍信噪比為定量下限(L O Q),計算出對位紅、蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ定量限分別為0.03~0.06mg/kg。

        表1 5種色素的標(biāo)準曲線、檢測限(LOD)和定量限(LOQ)Table 1 Standard curves, limit of detection, and limit of quantification for the five colorants

        2.3 回收率與變異系數(shù)

        圖1 UPLC-PDA的典型色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of blank sample, sudanⅠ-Ⅳ and para red standard, and blank sample spiked with the 5 compounds

        表2 UPLC-PDA檢測方法的回收率、日內(nèi)變異系數(shù)(n=6)及日間變異系數(shù)Table 2 Recoveries, coefficients of variation for the UPLC-PDA method (n=6)

        采用外標(biāo)法定量,以陰性樣品為測試樣品,添加不同質(zhì)量濃度水平的蘇丹紅,每個水平做6個平行樣,計算回收率和變異系數(shù)(CV),結(jié)果見表2。5種色素的日內(nèi)回收率范圍為61.7%~98.7%,變異系數(shù)為1.53%~7.55%。日間平均回收率為63.8%~96.2%,變異系數(shù)為0.52%~10.07%。其中蘇丹紅Ⅳ的回收率略低。典型色譜圖見圖1。

        2.4 實測樣本

        應(yīng)用所建立的方法,在北京市超市隨機抽檢100個樣品,其中有一例樣品檢出蘇丹紅Ⅳ,其含量為0.3mg/kg。色譜圖見圖2。

        圖2 UPLC-PDA方法測定的蘇丹紅Ⅳ陽性樣品Fig.2 UPLC chromatogram one sample containing sudan Ⅳ

        3 結(jié) 論

        采用氧化鋁為固相載體,利用固相基質(zhì)分散技術(shù)術(shù),建立禽蛋中對位紅、蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號5種色素的液相色譜測定方法。該方法較為簡單、方便,節(jié)省時間和溶劑?;厥章屎头€(wěn)定性滿足該類色素測定的要求,建議推廣使用。

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        Use of Matrix Solid-Phase Dispersion and Ultra Performance Liquid Chromatography for Determination of Para Red and SudanⅠ-Ⅳ in Egg Yolk

        HOU Xiao-lin1,SUN Ying-jian1,WU Guo-juan1,MIAO Hong2,WU Yong-ning2
        (1. Department of Animal Science, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China;2. Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China)

        An ultra-performance liquid chromatography (UPLC) method combined with matrix solid-phase dispersion (MSPD)was established for determination of para red and sudanⅠ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ in egg yolk. A total of 0.5 g egg yolk was mixed with 2 g of neutral alumina, then rinsed with 35 mL of hexane-acetone (0.5:99.5, V/V) through a 5 mL syringe. The eluent was heated to about 45℃ with nitrogen blowing to dryness and redissolved for UPLC analysis. Mean recovery for the five dyes ranged from 63.8% to 96.2%, with coefficient variation at 0.52%-10.07%. One sample was found containing sudan Ⅳ among the 100 samples.Key words:egg yolk;para red;sudanⅠ-Ⅳ;ltra-performance liquid chromatography;maxtrix solid-phase dispersion

        O657.31

        A

        1002-6630(2010)24-0285-04

        2010-01-07

        北京市屬高等學(xué)校人才強教計劃項目(PXM2009_014207_077729);國家“863”計劃項目(2007AA06Z404)

        侯曉林(1973—),男,副教授,博士,研究方向為獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)。E-mail:hxlsx@163.com

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