叢艷君，任發(fā)政*，云戰(zhàn)友

(1.北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100048；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010080)

αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇的識(shí)別

叢艷君1，任發(fā)政2,*，云戰(zhàn)友3

(1.北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100048；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010080)

以αs1-酪蛋白氨基酸序列為模板，錯(cuò)位合成αs1-酪蛋白多肽，以收集到的牛乳過(guò)敏患者血清為抗體，鑒定αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇，分析影響致敏性的關(guān)鍵氨基酸，探討牛乳過(guò)敏機(jī)理。結(jié)果表明：αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇有5條，它們?cè)讦羢1-酪蛋白的定位分別為aa21～35、aa26～40、aa91～105、aa141～155、aa186～200。影響αs1-酪蛋白致敏性的關(guān)鍵氨基酸為組氨酸、谷氨酸、脯氨酸。說(shuō)明特異性水解抗原決定簇或定點(diǎn)修飾過(guò)敏原氨基酸實(shí)現(xiàn)脫敏的方法是可行的。

牛奶；αs1-酪蛋白；IgE；抗原決定簇

酪蛋白大約占牛乳總蛋白的80%，是牛乳主要過(guò)敏原之一[1]，它由αs1-、αs1-、β-、κ-酪蛋白4種組分構(gòu)成，4種酪蛋白以37%、37%、1%和13%相對(duì)恒定的比例聚合成微粒-酪蛋白膠束，懸浮于乳清中[2]。αs1-酪蛋白是一條單鏈的磷酸化蛋白質(zhì)，由199個(gè)氨基酸構(gòu)成，脯氨酸含量較高[3]，沒(méi)有二硫鍵，三級(jí)結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單[4]，這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了αs1-酪蛋白的抗原決定簇以線性為主。

本研究應(yīng)用固相合成肽的方法合成αs1-酪蛋白多肽，以收集到的牛乳過(guò)敏患者血清中的IgE為探針，鑒定定位過(guò)敏原抗原決定簇，探討牛乳過(guò)敏機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

αs1-酪蛋白多肽 實(shí)驗(yàn)室合成；鏈霉親和素(streptavidin，SA) 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的鼠抗人IgE(ε鏈特異性)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、三氟乙酸(TFA) 美國(guó)Sigma公司；96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板 美國(guó)Costar公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bio-Rad 550型酶標(biāo)儀 Bio-Rad公司；PSH500A生化培養(yǎng)箱 中國(guó)重慶銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Th-80D-2B型凍干機(jī) 北京天地精儀科技有限公司；高效液相Vydac C18柱 美國(guó)Vydac公司。

1.3 方法

1.3.1 多肽的合成[5]

采用Fmoc固相肽合成法，將C-末端氨基酸連接到一種合適的固相載體上，采用常規(guī)Fmoc法進(jìn)行逐步縮合。合成結(jié)束后，用強(qiáng)酸將序列從固相載體上切割下來(lái)，經(jīng)HPLC純化，冷凍干燥后備用。

1.3.2 合成肽純度的鑒定

采用高效液相色譜(RP-HPLC)和質(zhì)譜進(jìn)行分析。色譜柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA水溶液，B為乙腈，采用按體積分?jǐn)?shù)梯度洗脫程序：0～5min，15% B；5～10min、20% B；10～30min，40% B。流速：1.0mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；柱溫：20℃。質(zhì)譜條件：采用ESI離子源；噴霧壓力：15psi；干燥氣溫度：350℃；流速：5L/min；掃描質(zhì)量范圍：m/z 500～2200。

1.3.3 牛奶過(guò)敏患者血清的收集

按照文獻(xiàn)[1]相關(guān)參數(shù)(典型的食物過(guò)敏史、皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)、Immunol CAP實(shí)驗(yàn))篩選牛乳過(guò)敏患者血清。6份牛乳過(guò)敏患者血清用來(lái)識(shí)別αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇，以A～F表示。另外取5份血清等體積混合分析影響αs1-酪蛋白致敏性的關(guān)鍵氨基酸。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)鑒定抗原決定簇及關(guān)鍵氨基酸

合成肽致敏性的檢測(cè)在96孔微板上進(jìn)行，每孔均先用鏈霉親和素包被，分別依次加入待進(jìn)行抗原決定簇鑒定的肽系列，再用抗體檢測(cè)，于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度，具體操作參考文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 αs1-酪蛋白肽的合成

表1 合成αs1-酪蛋白肽的氨基酸序列Table 1 Sequences of synthesized peptides based onαs1-casein

以αs1-酪蛋白氨基酸序列為模板，用Fmoc固相合成法錯(cuò)位合成αs1-酪蛋白37條，見(jiàn)表1。

2.2 合成肽的純度鑒定

圖1 Biotin-LNENLLRFFVAPFPE的MS圖譜Fig.1 MS spectrum of Biotin-LNENLLRFFVAPFPE

圖2 Biotin-RQFYQLDAYPSGAWY的MS圖譜Fig.2 MS spectrum of Biotin-RQFYQLDAYPSGAWY

合成的多肽通過(guò)高效液相純化，純度都達(dá)到了80%以上，進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜鑒定多肽的相對(duì)分子質(zhì)量(加上生物素的相對(duì)分子質(zhì)量)，圖1、2表明多肽相對(duì)分子質(zhì)量誤差均小于5%，本實(shí)驗(yàn)代表性地附上了兩條多肽(偶聯(lián)生物素)的質(zhì)譜圖。

2.3 αs1-酪蛋白的IgE抗原決定簇

圖3 A～F牛乳過(guò)敏患者識(shí)別αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇Fig.3 Identification ofαs1-casein epitopes in cow milk allergic patients

由圖3可知，A患者識(shí)別到的抗原決定簇為A01、A02、A03、A16、A18、A26、A35；B患者識(shí)別到的抗原決定簇為A02、A03、A07、A20、A26、A30、A37；C患者識(shí)別到的抗原決定簇為A05、A13、A16、A26、A35；D患者識(shí)別到的抗原決定簇為A02、A05、A16、A22、A26、A31、A35；E患者識(shí)別到的抗原決定簇為A02、A03、A16、A18、A26、A35；F患者識(shí)別到的抗原決定簇為A02、A03、A07、A16、A18、A26、A35。

從圖3還可以看出，不同牛乳過(guò)敏患者識(shí)別到的抗原決定簇不同，A26的識(shí)別率為100%(6/6，即與6份血清均發(fā)生免疫反應(yīng))，A02、A16、A35的識(shí)別率為83.3% (5/6)，A03的識(shí)別率為66.7%(4/6)，個(gè)別過(guò)敏患者對(duì)A18、A07、A20、A22也有免疫反應(yīng)，A26、A02、A16、A35、A03的識(shí)別率在60%以上，故為αs1-酪蛋白的IgE抗原決定簇，它們的氨基酸序列分別為：GIHAQQKEPMIGVNQ、IKHQGLPQEVLNENL、VEQKHIQKEDVPSER、TQYTDAPSFSDIPNP、LPQEVLNENLLRFFV，這些抗原決定簇在αs1-酪蛋白的氨基酸序列定位分別為aa141～155、aa21～35、aa91～105、aa186～200、aa26～40(圖4粗體部分)。用非牛乳過(guò)敏患者血清識(shí)別抗原決定簇的光密度值均小于0.1。

圖4 IgE抗原決定簇在αs1-酪蛋白序列中的定位Fig.4 Locations of IgE epitopes in the sequence ofαs1-casein

2.4 顯性抗原決定簇(GIHAQQKEPMIGVNQ)關(guān)鍵氨基酸的分析

圖5 影響αs1-酪蛋白致敏性的關(guān)鍵氨基酸Fig.5 Critical amino acids for the allergenicity ofαs1-casein

為了找到影響致敏性的關(guān)鍵氨基酸，本研究選用分

子較小的中性丙氨酸作為取代氨基酸(遇到丙氨酸以甘氨酸作取代)。用丙氨酸依次取代GIHAQQKEPMIGVNQ抗原決定簇的氨基酸，以未取代的抗原決定簇作空白對(duì)照，由圖5可知，第143位的組氨酸(H)被丙氨酸取代合成的肽光密度值接近零，第148位的谷氨酸(E)被丙氨酸取代合成的多肽及第149位的脯氨酸(P)被丙氨酸取代合成的多肽的IgE結(jié)合能力消失，其他氨基酸被取代后合成的多肽IgE結(jié)合能力與對(duì)照差異不顯著。因此組氨酸、谷氨酸、脯氨酸是影響αs1-酪蛋白致敏性的關(guān)鍵氨基酸。

3 討 論

牛奶酪蛋白組分是引起成年人和年長(zhǎng)兒童過(guò)敏的主要過(guò)敏原，這表明酪蛋白在持續(xù)性牛乳過(guò)敏疾病中發(fā)揮著重要作用[7-8]。一般認(rèn)為過(guò)敏原的致敏性是由蛋白的初級(jí)、二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)決定的。通過(guò)尿素、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸鈉或加熱方式處理α-酪蛋白，打破其二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，但是并未顯著影響到α-酪蛋白的致敏性[9]，這表明α-酪蛋白的初級(jí)結(jié)構(gòu)(序列抗原決定簇)對(duì)其致敏性變化影響最顯著。

Chatchatee等[10]采用96個(gè)重疊十肽，確定了αs1-酪蛋白6個(gè)主要和3個(gè)次要IgE抗原決定簇。Elsayed等[11]用溴化氫將αs1-酪蛋白裂解為7個(gè)肽段，除了一個(gè)肽段只含3個(gè)氨基酸外，其余均可以被T細(xì)胞識(shí)別，從而確定了7個(gè)T細(xì)胞識(shí)別表位。在此基礎(chǔ)上，Ruiter等[12]采用了32個(gè)重疊肽分析T細(xì)胞識(shí)別表位，其中肽鏈43～66位、73～96位、91～114位、127～180位均可被3個(gè)病人的T細(xì)胞所識(shí)別，而肽鏈133～156位則被50%以上過(guò)敏病人的T細(xì)胞所識(shí)別，說(shuō)明此區(qū)域?yàn)門(mén)細(xì)胞主要識(shí)別表位。本研究識(shí)別到αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇5條，這些抗原決定簇在αs1-酪蛋白的氨基酸序列定位分別為aa141～155、aa21～35、aa91～105、aa186～200、aa26～40，抗原決定簇aa91～105與Ruiter等[12]發(fā)現(xiàn)的肽鏈91～114位是一致的，抗原決定簇aa141～155、aa21～35、aa186～200、aa26～40是之前研究沒(méi)有報(bào)道過(guò)的。

關(guān)于αs1-酪蛋白抗原決定簇的關(guān)鍵氨基酸的研究報(bào)道很少。Cocco等[13]研究表明：以牛乳過(guò)敏患者混合血清為抗體，取代αs1-酪蛋白單個(gè)氨基酸可以降低或消除抗原決定簇IgE結(jié)合能力，這與本研究的結(jié)論是一致。

4 結(jié) 論

本研究識(shí)別的αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇定位分別為aa141～155、aa21～35、aa91～105、aa186～200、aa26～40，通過(guò)對(duì)肽鏈141～155取代分析表明，取代單個(gè)氨基酸可以降低或消除αs1-酪蛋白IgE結(jié)合能力。

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Identification of IgE-binding Epitopes on αs1-Casein

CONG Yan-jun1，REN Fa-zheng2,*，YUN Zhan-you3
(1. School of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；3. Inner Mongolia Yili Industrial Group Co. Ltd., Hohhot 010080, China)

A series of casein overlapping decapeptides (offset by 5 amino acids) were synthesized on the basis of the sequence of αs1-casein. IgE-binding epitopes were identified using individual sera from cow milk allergic patients. Moreover, the critical amino acids (AAs) for IgE binding were explored. The results indicated that five IgE-binding epitopes were identified to locate in the sequence of aa21－35, aa26－40, aa91－105, aa141－155 and aa186－200, respectively. In addition, histidine, glutamic acid and proline were the critical amino acids for the allergenicity of αs1-casein.

cow milk；αs1-casein；IgE；epitope

TS252.1

A

1002-6630(2010)17-0232-04

2010-01-02

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD04A06)

叢艷君(1978—)，女，講師，博士，主要從事功能乳制品研究。E-mail：congyj@th.btbu.edu.cn

*通信作者：任發(fā)政(1962—)，男，教授，博士，主要從事功能乳制品研究。E-mail：renfazheng@263.net