周建新，張 弘，何 榮，王 璐，鞠興榮，袁 建

(南京財經(jīng)大學(xué) 江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210003)

雅致放射毛霉固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)菜籽肽工藝條件研究

周建新，張 弘，何 榮，王 璐，鞠興榮，袁 建

(南京財經(jīng)大學(xué) 江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210003)

以肽得率、氮溶解指數(shù)和氨基酸態(tài)氮為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)研究工藝條件對雅致放射毛霉固態(tài)發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)菜籽肽的影響。結(jié)果表明：在菜籽粕顆粒直徑為0.18～0.28mm，培養(yǎng)基中菜籽粕與發(fā)酵劑之比為1:1 (m/V)，葡萄糖添加量為3%，KH2PO4添加量為0.5%，pH值為9.0，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為96h時，發(fā)酵指標(biāo)最好。

雅致放射毛霉；固態(tài)發(fā)酵；菜籽肽；工藝條件；肽得率；氮溶解指數(shù)；氨基酸態(tài)氮

我國油菜籽年產(chǎn)量達(dá)1200萬t，這些油菜籽加工成油后可得到700多萬t菜籽粕[1]，相當(dāng)于300多萬t粗蛋白。而由菜籽蛋白水解得到的菜籽肽，其加工特性如溶解性、乳化性、持水性等均有明顯提高[2]，同時具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤和促進(jìn)動物細(xì)胞生長等生物學(xué)活性[3-5]，其應(yīng)用前景非常廣闊，市場潛力巨大。

目前國內(nèi)外有關(guān)菜籽肽制備方法的研究主要是酶水解法[6]，該法需要先從菜籽粕中提取蛋白后再進(jìn)行酶水解，從而使工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高。固態(tài)發(fā)酵法主要是在幾乎沒有游離水的濕固體材料上培養(yǎng)微生物的工藝過程，具有投資少，能耗低，技術(shù)較簡單；產(chǎn)物的產(chǎn)率較高；基質(zhì)含水量低，可大大減少生物反應(yīng)器的體積，不需要廢水處理，環(huán)境污染較少，后處理加工方便等優(yōu)點(diǎn)。雅致放射毛霉是傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品的常用發(fā)酵菌種，具有很強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)能力[7]。本實(shí)驗(yàn)在對該菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽初步研究的基礎(chǔ)上[8]，探討固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)菜籽肽的工藝條件，以期為進(jìn)一步優(yōu)化菜籽肽生產(chǎn)工藝條件提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菜籽粕(品種canola)：菜籽經(jīng)礱谷機(jī)進(jìn)行脫殼后粉碎，再用索氏抽提法進(jìn)行脫油處理即得到實(shí)驗(yàn)用菜籽粕。

1.2 菌種

雅致放射毛霉40252(Actinomucor elegans)由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供。

1.3 儀器與設(shè)備

YXQ.SG41.280型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；SW-CJ-1型超凈工作臺 江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司；PHS-3C型精密數(shù)顯pH計、722N型紫外-可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器廠；GL-20B型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PQX型多段可編程人工氣候箱 寧波東南儀器有限公司。

1.4 方法

稱取10g菜籽粕，裝入150mL錐形瓶中，滅菌(121℃、30min)，冷卻，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)接入發(fā)酵劑(將活化后的斜面菌種接種于PDA平板培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，用無菌水洗滌霉菌孢子，調(diào)節(jié)為每mL液體種子中有4×107個孢子[9]。無菌水中事先加入葡萄糖和KH2PO4，調(diào)節(jié)pH值，即得發(fā)酵劑)，28℃恒溫培養(yǎng)(定時翻動通氣)，發(fā)酵后的固態(tài)基質(zhì)，加蒸餾水定容至150mL，攪拌30min，4500r/min離心20min，用0.45μm微孔濾膜過濾上清液，去除不溶物和細(xì)菌后測定指標(biāo)。

通過單因素試驗(yàn)，研究菜籽粕顆粒直徑、培養(yǎng)基料液比(菜籽粕:發(fā)酵劑)、發(fā)酵劑中KH2PO4與葡萄糖的添加量(分別以培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加)、初始pH值、發(fā)酵溫度與時間對氮溶解指數(shù)、氨基酸態(tài)氮和肽得率的影響。

1.5 發(fā)酵指標(biāo)測定

氮溶解指數(shù)：凱氏定氮法[10]；氨基酸態(tài)氮：甲醛滴定法[11]；肽得率：雙縮脲比色法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菜籽粕顆粒直徑對發(fā)酵指標(biāo)的影響

培養(yǎng)基中料液比(菜籽粕:發(fā)酵劑)為1:1(m/V)，發(fā)酵劑加入KH2PO40.3%、葡萄糖3%，起始pH6.0，28℃發(fā)酵72h，考察菜籽粕的不同顆粒直徑對發(fā)酵指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 菜籽粕顆粒直徑對發(fā)酵指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of rapeseed meal granular diameter on fermentation indexes

由圖1可知，隨著菜籽粕顆粒直徑的增大，3個指標(biāo)均呈現(xiàn)先增加后下降的態(tài)勢。當(dāng)顆粒直徑在0.18～0.28mm時，3個指標(biāo)均達(dá)到最大值。固態(tài)發(fā)酵底物顆粒的大小直接影響到單位體積反應(yīng)表面積，也會影響顆粒間菌體的生長、氧的供給率及二氧化碳的移出率等。一般來講，小的底物顆?？梢蕴峁┹^大微生物攻擊表面積，可以明顯提高固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)速率，被認(rèn)為是理想的選擇。但是，在許多情況下太小的顆粒容易造成底物積團(tuán)，顆粒間空隙率也減小，導(dǎo)致阻力增大，對傳熱、傳質(zhì)產(chǎn)生不利影響，以致于妨礙微生物的呼吸或通氣，結(jié)果導(dǎo)致微生物不良生長[13]，因此本實(shí)驗(yàn)為得到最佳的發(fā)酵效果選用基質(zhì)顆粒直徑為0.18～0.28mm。

2.2 培養(yǎng)基不同料液比對發(fā)酵指標(biāo)的影響

用顆粒直徑0.18～0.28mm菜籽粕配制培養(yǎng)基，發(fā)酵劑中加入KH2PO40.3%，葡萄糖3%，起始pH值為6.0，28℃發(fā)酵72h，考察培養(yǎng)基中不同料液比對發(fā)酵指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 培養(yǎng)基料液比對發(fā)酵指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on fermentation indexes

由圖2可知，3個指標(biāo)都是在培養(yǎng)基中料液比為1:1時達(dá)到峰值。培養(yǎng)基含水量對微生物的生長及代謝能力產(chǎn)生重要影響。含水量過低，造成基質(zhì)膨脹程度低，物料較干燥，微生物難以生長，產(chǎn)酶量降低。含水量過高，減少了基質(zhì)內(nèi)氣體體積和氣體交換，也不利于菌種的生長[14-15]。

2.3 培養(yǎng)基中不同葡萄糖添加量對發(fā)酵指標(biāo)的影響

圖3 葡萄糖添加量對發(fā)酵指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of glucose amount on fermentation indexes

用顆粒直徑0.18～0.28mm菜籽粕，發(fā)酵劑中加入KH2PO40.3%，培養(yǎng)基料液比為1:1，起始pH6.0，28℃發(fā)酵72h，考察不同葡萄糖添加量對發(fā)酵指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，肽得率、氨基酸態(tài)氮和氮溶解指數(shù)都呈現(xiàn)升高后降低趨勢，3個指標(biāo)變化趨勢相對比較同步。肽得率和氨基酸態(tài)氮有一定的區(qū)分度，但差別并不十分明顯，而氮溶解指數(shù)一直下降且下降幅度比較大。一定添加量的葡萄糖有利于多肽得率的提高，因?yàn)槠咸烟鞘且环N速效碳源，在發(fā)酵中菌種需要大量碳源以維持持續(xù)生長勢頭，從而能夠大量產(chǎn)酶水解菜籽粕中的菜籽蛋白；但是過高的葡萄糖添加量反而降低多肽產(chǎn)量，原因是發(fā)酵過程中過多的葡萄糖會過分加速菌體的呼吸作用，以致培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，生長和產(chǎn)酶受到抑制[16]。綜合考慮優(yōu)化的葡萄糖添加量為3%。

2.4 培養(yǎng)基中不同KH2PO4添加量對發(fā)酵指標(biāo)的影響

用顆粒直徑0.18～0.28mm菜籽粕，葡萄糖添加量為3%配制發(fā)酵劑，培養(yǎng)基料液比為1:1，起始pH6.0，28℃發(fā)酵72h，考察不同添加量的KH2PO4對發(fā)酵指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 KH2PO4添加量對發(fā)酵指標(biāo)的影響Fig.4 Effect of KH2PO4amount on fermentation indexes

由圖4可知，肽得率和氨基酸態(tài)氮的變化趨勢是先升后降趨勢；而氮溶解指數(shù)在KH2PO4添加量0.1%～0.3%范圍內(nèi)變化不大，并隨著KH2PO4添加量(0.5%～0.9%)的增加而降低。KH2PO4除了提供微生物生長所需的礦質(zhì)元素外，還可以穩(wěn)定培養(yǎng)基的pH值，隨著鹽濃度的增加，導(dǎo)致發(fā)酵過程pH值變化不大，而低酸性條件雖然有利于雅致放射毛霉的生長，卻不利于其所產(chǎn)蛋白酶水解效果的發(fā)揮。綜合考慮較佳KH2PO4添加量為0.5%。

2.5 培養(yǎng)基不同pH值對發(fā)酵指標(biāo)的影響

圖5 培養(yǎng)基pH值對發(fā)酵指標(biāo)的影響Fig.5 Effect of initial pH on fermentation indexes

用顆粒直徑0.18～0.28mm菜籽粕，發(fā)酵劑中葡萄糖添加量為3%，KH2PO4添加量為0.5%，培養(yǎng)基料液比為1:1，28℃發(fā)酵72h，考察培養(yǎng)基起始不同pH值對發(fā)酵指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，在pH3～11范圍內(nèi)，肽得率、氨基酸態(tài)氮和氮溶解指數(shù)都呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，3個指標(biāo)變化相對比較同步，并且在pH9時達(dá)到最大值。原因可能是雅致放射毛霉所產(chǎn)蛋白酶是堿性蛋白質(zhì)酶[17]，同時堿性條件下菜籽蛋白更容易從菜籽粕中溶出，蛋白質(zhì)水解效果相對較好。另外，過高的pH值不利于雅致放射毛霉的生長和酶解作用的發(fā)揮。綜合考慮優(yōu)化pH值為9。

2.6 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵指標(biāo)的影響

用顆粒直徑0.18～0.28mm菜籽粕，培養(yǎng)基中葡萄糖添加量為3%，KH2PO4添加量為0.5%，培養(yǎng)基料液比為1:1，pH值為9，28℃發(fā)酵，考察不同發(fā)酵時間對發(fā)酵指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 發(fā)酵時間對發(fā)酵指標(biāo)的影響Fig.6 Effect of fermentation time on fermentation indexes

由圖6可知，隨著發(fā)酵時間的增加，肽得率是明顯的先增加后趨于穩(wěn)定的態(tài)勢；氨基酸態(tài)氮和氮溶解指數(shù)則都是呈現(xiàn)出先增加后下降的態(tài)勢。肽得率的變化趨勢比較明顯，在發(fā)酵前96h內(nèi)不斷增加，96h以后趨于穩(wěn)定，在96h時達(dá)到峰值；氨基酸態(tài)氮的區(qū)分度明顯，隨著時間的增加則先增加，在48h時到達(dá)峰值，隨后劇烈下降；氮溶解指數(shù)在24h時極低，在48h達(dá)到峰值，二者差別很大，在48h以后不斷下降，但下降幅度不是很大。氮溶解指數(shù)和氨基酸態(tài)氮都是在48h時到達(dá)峰值，隨著發(fā)酵時間的延長有所降低，其原因可能是微生物生長利用了其中的無機(jī)氮?？紤]到肽得率是最主要的指標(biāo)，所以發(fā)酵時間定為96h。

2.7 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵指標(biāo)的影響

用顆粒直徑0.18～0.28mm菜籽粕，發(fā)酵劑中葡萄糖添加量為3%，KH2PO4添加量為0.5%，培養(yǎng)基料液比為1:1，pH值為9.0，發(fā)酵時間96h，考察不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，溫度對于發(fā)酵指標(biāo)的影響比較明顯，3個指標(biāo)都是在30℃時達(dá)到最高值，所以選擇發(fā)酵溫度為30℃。

圖7 發(fā)酵溫度對發(fā)酵指標(biāo)的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on fermentation indexes

3 結(jié) 論

以肽得率、氮溶解指數(shù)和氨基酸態(tài)氮為指標(biāo)，研究了工藝條件對雅致放射毛霉固態(tài)發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)菜籽蛋白肽的影響。通過單因素試驗(yàn)得出雅致放射毛霉發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的工藝條件為菜籽粕顆粒直徑0.18～0.28mm，培養(yǎng)基中菜籽粕與發(fā)酵劑之比為1:1，培養(yǎng)基中添加葡萄糖3%，磷酸二氫鉀0.5%，pH值為9.0，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為96h，在此條件下，發(fā)酵菜籽粕的肽得率為10.14%，氮溶解指數(shù)為80.02%，氨基酸態(tài)氮為2.16%，發(fā)酵效果較好。優(yōu)化發(fā)酵條件還有待于進(jìn)一步研究。

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An Investigation on Some Technological Conditions for Solid-state Fermentation by Actinomucor elegans for the Production of Rapeseed Peptides

ZHOU Jian-xin，ZHANG Hong，HE Rong，WANG Lu，JU Xing-rong，YUAN Jian
(Jiangsu Provincial Key Laboratory of Quality Control and Further Processing of Grain and Oils, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China)

The production of rapeseed peptides based on solid-state fermentation by Actinomucor elegans was investigated by one-factor-at-a-time method with respect to the effects of some technological conditions on rapeseed peptide yield, nitrogen solubility index and amino nitrogen. The optimal technological conditions were determined as follows: rapeseed meal granular diameter, 0.18 to 0.28 mm, solid-to-liquid ratio 1:1, glucose amount 3%, KH2PO4 amount 0.5%, pH 9.0, fermentation temperature 30 ℃ and fermentation time 96 h.

Actinomucor elegans；solid-state fermentation；rapeseed peptide；technological conditions；peptide yield；nitrogen solubility index；amino nitrogen

TQ936.16

A

1002-6630(2010)17-0214-04

2010-01-18

國家“863”計劃項(xiàng)目(2007AA10Z331)；農(nóng)業(yè)部科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2009C10045)

周建新(1964—)，男，教授，碩士，主要從事食品發(fā)酵研究。E-mail：zhoujx1964@163.com