雷攀登，孫俊，張正竹?

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學茶及藥用植物安全生產(chǎn)重點開放實驗室，合肥 230036；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學園藝學院，合肥 230036）

茶樹腋芽初代培養(yǎng)過程中外植體褐化的控制措施研究

雷攀登1，孫俊2，張正竹1?

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學茶及藥用植物安全生產(chǎn)重點開放實驗室，合肥 230036；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學園藝學院，合肥 230036）

有效控制外植體褐變是茶樹組織培養(yǎng)的關鍵技術。本文研究了外植體取材季節(jié)、切取方法、培養(yǎng)溫度和不同抗氧化劑對外植體褐變率的影響。結果表明：春季材料的外植體污染率、褐變率比秋季的低，腋芽萌發(fā)率比秋季的高；外植體留部分葉柄、接種前用2.0 g?L-1PVP溶液浸泡30 min、接種后在8℃避光培養(yǎng)16h可以有效降低外植體褐化率。春季材料、合適的外植體類型、培養(yǎng)溫度及抗氧化劑的良好組合，有助于提高茶樹腋芽初代培養(yǎng)的成功率。

茶樹；腋芽；組織培養(yǎng)；褐化

褐化現(xiàn)象在植物組織培養(yǎng)中普遍存在，外植體褐化是植物組織培養(yǎng)的一大難題。在木本植物組織培養(yǎng)過程中，外植體褐化現(xiàn)象普遍發(fā)生。褐化的主要原因是外植體組織被切割后，多酚類化合物從切口處向外分泌，多酚氧化酶被激活，多酚類物質(zhì)被氧化形成褐色有毒的醌類物質(zhì)，損傷切面迅速變成棕褐色或暗褐色，褐色物逐漸向培養(yǎng)基中擴散，抑制其它酶的活性，毒害整個外植體組織，外植體隨之進一步變褐而最終死亡[1,2]。外植體的基因型、外植體年齡、大小、部位、種類、培養(yǎng)基成分、激素水平和培養(yǎng)條件等因素都會影響褐化的發(fā)生[3]。在緩解植物組織培養(yǎng)褐化的措施中，除了選擇適宜的外植體及培養(yǎng)基外，多采用抗氧化劑或吸附劑處理，常用的抗氧化劑和吸附劑有抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和活性炭等[4-6]。

茶葉中含有較多的易被氧化的多酚類物質(zhì)，所以在組培過程中外植體容易發(fā)生褐化，嚴重時外植體會因褐化而死亡。本文以龍井-43的腋芽為外植體，初步探討了取材季節(jié)、外植體類型、不同抗氧化劑和培養(yǎng)溫度對茶樹腋芽初代培養(yǎng)時外植體褐化的影響，以期篩選出較好的防褐化措施，為進一步開展茶樹組織培養(yǎng)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與外植體的處理

取龍井-43當年生未木質(zhì)化或半木質(zhì)化的健壯新梢，采自安徽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)園。將采集的新梢用流水沖洗掉表面塵土，用0.1%的多菌靈表面清洗，沖洗干凈，室內(nèi)水培一周。試驗時剪成長約1cm的帶單個腋芽的莖段，在無菌操作條件下，先用75%酒精消毒約8s，無菌水漂洗3次，再用0.1% HgCl2+0.1%吐溫-20在100rpm搖床上消毒8～9min，無菌水漂洗數(shù)次。消毒后的材料約10個分置在無菌的培養(yǎng)皿中，進行接種。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

采用1/2 MS為基本培養(yǎng)基，附加BA 2.0 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1+ GA33.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂 7.0 g·L-1，滅菌前pH值為5.8。接種后遮光培養(yǎng)7d。光照培養(yǎng)光照周期為16h光照，8h黑暗。培養(yǎng)溫度為25±2℃。

1.3 試驗處理

1.3.1 取材季節(jié)

以春季腋芽和秋季腋芽為外植體，研究了不同季節(jié)外植體的污染率、褐化率、萌發(fā)率。

1.3.2 對外植體褐化的控制

采用春季材料，對外植體的切取方法進行了研究，外植體采用了：Ⅰ.斜切腋芽，不帶莖段和葉；Ⅱ.腋芽帶莖段；Ⅲ.腋芽帶莖段，留少量葉柄三種處理。帶莖段的外植體均是下端斜切，上端平切。

外植體接種于添加不同抗氧化劑的培養(yǎng)基中。各種抗氧化劑的濃度分別為（1）維生素C（Vc）0.5、1.0、2.0 g?L-1；（2）活性炭（AC）0.25、 0.5、1.0 g?L-1；（3）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.5、1.0、2.0 g?L-1。 此外，外植體接種之前，用2.0 g?L-1PVP溶液（過濾除菌）浸泡30 min，然后接種于未添加抗氧化劑的培養(yǎng)基中。

外植體接種后置于8℃避光培養(yǎng)16h，再置于25℃培養(yǎng)，以始終置于25℃培養(yǎng)為對照。

1.3.3 上述各因素的組合效果

待確定了各因素的最佳抑制褐化效果后，將其組合應用于茶樹腋芽培養(yǎng)，考察各因素的組合對外植體褐化的抑制效果。

以上每個處理均重復3次。

1.4 評價標準與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

腋芽的萌發(fā)狀況采用萌動和萌發(fā)兩個評價標準。萌動，即腋芽膨大，未展開葉；萌發(fā)，即腋芽膨大，繼而形成新梢，有展開葉。外植體接種后4周左右進行萌動率統(tǒng)計，8周左右進行萌發(fā)率統(tǒng)計。

污染率、褐化率分別于接種后7d～15d和3d～7d統(tǒng)計。污染率=（污染的外植體/接種的外植體）×100﹪；褐化率=（褐化的外植體/接種的外植體）×100﹪；無污染率=（無污染的外植體/接種的外植體）×100﹪；萌動率=（萌動的外植體/接種的外植體）×100﹪；萌發(fā)率=（萌發(fā)的外植體/接種的外植體）×100﹪。

2 結果與分析

2.1不同季節(jié)外植體的污染率、褐化率、萌發(fā)率比較

表1 不同季節(jié)外植體污染率、褐化率、萌發(fā)率比較

由表1可知：新梢萌發(fā)季節(jié)即芽的生育狀態(tài)對外植體的污染率、褐變率和萌發(fā)有很大影響。秋季材料的污染率較高可能是由于腋芽經(jīng)過了近半年的生長，鱗片較多，潛伏的有害菌較多，外植體表面消毒又很難將其完全殺滅；春季的腋芽生長時間較短，自身帶菌較少，消毒相對容易，所以污染率較秋季低。春季新梢多酚類含量比秋梢低，春季外植體的褐化率相比秋季外植體低；秋季的腋芽可以萌動，但是沒有伸長形成新梢，春季的腋芽萌發(fā)后生長較快，部分腋芽16周就可以生長至6cm。

2. 2 外植體切取方法與培養(yǎng)結果的關系

表2 不同類型外植體褐變率、萌發(fā)率比較

試驗結果表明（表2），外植體的受傷害程度與褐變程度有較大關系。這主要由于不同的切取方法，留下的傷口面積不同，傷口面積越大，表面消毒劑對外植體傷害越多，褐變程度越重。此外，外植體組織受傷害程度直接影響萌發(fā)，腋芽帶莖段留部分葉柄的外植體接種兩周后就開始萌動，葉柄也會逐漸從基部脫落，第8周外植體萌發(fā)率可以達到10.5%，而單獨的腋芽萌發(fā)率為0。

2. 3 不同抗氧化劑對茶樹腋芽褐化的影響

抗氧化劑抑制褐化的作用在其它植物組培中已有許多報道。我們選用了幾種抗氧化劑和吸附劑加入培養(yǎng)基中，以及使用PVP溶液浸泡外植體（以不加的培養(yǎng)基為對照），結果表明，培養(yǎng)基中加入維生素C（0.5～2.0 g·L-1）、活性炭（0.25～1.0 g·L-1）、聚乙烯吡咯烷酮（0.5～2.0 g·L-1），均可不同程度減少外植體褐化的發(fā)生，抑制效果最佳的是使用2.0g·L-1PVP溶液浸泡外植體30min（表3）。

表3 維生素C、活性炭、聚乙烯吡咯烷酮對茶樹腋芽褐變的影響

2. 4 培養(yǎng)溫度對茶樹腋芽褐化的影響

在試驗中發(fā)現(xiàn)，把接種后的茶樹腋芽分別在高溫（25℃）和低溫（8℃）條件下培養(yǎng)，高溫培養(yǎng)可明顯促使褐化的發(fā)生，褐化率達 38.7%，而低溫條件下褐化率為20.6%。因為高溫能促進多酚氧化酶的生物活性，從而促進多酚類物質(zhì)的氧化，加速外植體褐化，而低溫可以抑制酚類化合物的合成，降低多酚氧化酶的活性，抑制多酚類氧化，從而減輕外植體褐化。

2. 5 上述因素組合效果的考察

春季茶樹新梢為材料，腋芽帶莖段留少量葉柄為外植體，培養(yǎng)基中不添加任何抗氧化劑和吸附劑?？疾焱庵搀w接種前在2.0 g·L-1PVP溶液浸泡30min、接種后在8℃條件下避光處理16h對外植體褐化的抑制效果。以外植體直接接種且接種后直接置于25±2℃培養(yǎng)為對照。

試驗結果發(fā)現(xiàn)，各因素組合后外植體褐化率為8.9%，對照的褐變率29.3%，外植體的褐化率顯著降低。

3 討論

在影響茶樹腋芽褐化的眾多因素中，本試驗首先對培養(yǎng)材料的生長季節(jié)和生理狀態(tài)進行了選擇，因為植物的不同生長季節(jié)和生理狀態(tài)在組織培養(yǎng)中發(fā)生褐變的頻率和程度都存在很大的差別。外植體在不進行任何褐化控制的條件下培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)的結果（表1），篩選出褐化發(fā)生輕、污染率低、萌發(fā)率高的春季茶樹腋芽作為適宜的培養(yǎng)材料。在參考了茶樹[7,8]、油茶[5]、核桃[4]組織培養(yǎng)方面的研究結果后，確定了1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加BA 2.0mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1+ GA33.0 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂7.0 g·L-1，作為茶樹腋芽初代培養(yǎng)的的培養(yǎng)基。

外植體組織受傷害程度直接影響褐化和萌發(fā)（表2），與單獨腋芽的作為外植體相比，腋芽帶莖段留少量葉柄的外植體，其褐化率明顯降低，萌發(fā)率也較高。

本試驗通過在培養(yǎng)基中添加不同種類和濃度的抗氧化劑對抑制褐變的效果進行研究，其總體結果為PVP ＞Vc ＞AC，且均比對照好，尤其是接種前使用2.0 g·L-1PVP溶液浸泡外植體30min抑制褐化的效果最佳。這與對油茶[5]和中國李[6]的研究結果較為一致。

在初代培養(yǎng)時把外植體處于不適合酚類合成或降低多酚氧化酶活性的條件下，如在黑暗或弱光及低溫下培養(yǎng)，可抑制多酚類物質(zhì)的氧化，從而減輕外植體褐化。在“薄殼香”核桃[4]的愈傷組織誘導時，把外植體分別培養(yǎng)在高溫（25±2℃）和低溫（18±2℃）條件下培養(yǎng)，高溫培養(yǎng)褐化率達52.7%，而低溫條件下褐化率為29.8%。油茶莖尖[5]在l0℃恒溫箱中處理3d后再置于（25±2℃）的室內(nèi)培養(yǎng)，可在一定程度上減輕外植體的褐化反應。

春季材料適宜做腋芽培養(yǎng)，可以降低外植體的污染率與褐變率，提高腋芽萌發(fā)率。腋芽帶莖段留部分葉柄、外植體接種前在2.0 g·L-1PVP溶液浸泡30min、接種后在8℃條件下避光處理16h能夠明顯減輕褐化。

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S336

A

1006-5768(2010)03-0101-04

2010-05-06

雷攀登（1983- ），男，安徽蕭縣人，碩士研究生，研究方向：茶葉生物化學及天然產(chǎn)物研發(fā)。*

zzz@ahau.edu.cn。