劉 靜
(安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院,陜西 安康 725000)
茶樹[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]屬山茶科山茶屬多年生木本植物[1]。茶葉為我國重要的飲料作物,茶葉中的茶多酚類、植物堿、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等有機化學(xué)成分和無機礦物元素具有很高的價值[2]。茶樹為異花授粉,其高度的自交不親合性、自交衰退、結(jié)實率低等因素限制了遺傳改良工作的進行[3]。茶樹按照繁殖方式的不同分為種子繁殖和無性繁殖,種子直播簡單易行,成本低廉,但是由于茶樹容易發(fā)生性狀分離導(dǎo)致優(yōu)良性狀丟失,對茶園的長久發(fā)展帶來了很大的困難。無性繁殖以扦插為主,但是該方法在育苗周期、繁殖系數(shù)、對自然環(huán)境的要求方面有一定的缺陷,在茶樹新品種育成時,先需要經(jīng)過多年的原種擴繁,等完成一定規(guī)模后,才能進行大面積栽種,這使得茶樹新品種的繁育和推廣速度受到限制[4],利用植物組織培養(yǎng)來生產(chǎn)種苗,不僅可以保持優(yōu)良性狀,縮短育種年限,實現(xiàn)快速繁殖,還可以避免環(huán)境對育種時間的限制,實現(xiàn)批量化、大規(guī)模生產(chǎn)。在茶樹的繁殖過程中,利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對葉片、莖段、腋芽以及根等外植體進行誘導(dǎo)來獲得完整的植株,再進行移栽。為建立茶樹高效組織培養(yǎng)體系提供依據(jù)。
實驗材料為“陜茶一號”茶樹幼嫩枝條,由安康市雙龍鎮(zhèn)三星茶廠提供。
取茶樹幼嫩枝條,切至長2 cm左右的帶芽莖段,將帶芽莖段流水沖洗2 h,在超凈工作臺中用75%的酒精消毒30 s,再用0.1%氯化汞消毒滅菌8 min,用無菌水沖洗5~6次后接種于不同培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光照8~10 h·d-1,光照強度1 500~2 000 lx。
1.2.1 不同取材時間對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響 分別于4月上旬、5月上旬、6月上旬取茶樹幼嫩莖段,將消毒過的莖段接種在MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上,每個月份的材料接種20瓶,每瓶接種2~3個外植體,重復(fù)三次。接種40 d后比較不同取材時間對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響,統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)率。
腋芽誘導(dǎo)率(%)=(分化出腋芽的外植體數(shù)/未污染外植體總數(shù))×100%
1.2.2 外植體不同放置方式對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響 將茶樹帶腋芽莖段滅菌以后接種在MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1培養(yǎng)基上,共接種40瓶,每瓶2~3個外植體,其中20瓶培養(yǎng)基中莖段水平放置,另外20瓶培養(yǎng)基中莖段基部插入培養(yǎng)基,重復(fù)三次。觀察腋芽的生長情況,40 d以后比較莖段不同放置方式對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響,統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)率。
腋芽誘導(dǎo)率(%)=(腋芽萌發(fā)的外植體數(shù)/外植體總數(shù))×100%
1.2.3 附加不同濃度激素的MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基和對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響 將消毒過的帶腋芽莖段接種到不同的培養(yǎng)基(1.MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-12.MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-13.MS+BA2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-14.MS+BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-15.1/2MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-16.1/2MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-17.1/2MS+BA2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-18.1/2MS+BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1)上。每瓶培養(yǎng)基中接種2~3個外植體,每種培養(yǎng)基接種20瓶。重復(fù)三次。接種40 d后統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)率,比較不同培養(yǎng)基對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響。
腋芽誘導(dǎo)率(%)=(分化出腋芽的外植體數(shù)/未污染外植體總數(shù))×100%
從表1中可以看出,4月上旬茶樹腋芽誘導(dǎo)率為71%,5月上旬腋芽誘導(dǎo)率為88%,6月上旬腋芽誘導(dǎo)率為77%。與4月和6月相比,5月份外植體誘導(dǎo)率較高。茶樹為多年生灌木,其最適的生長溫度為20~30℃,4月份氣溫開始回升,茶樹開始抽枝生長,處于生長初期的枝條比較幼嫩,在消毒過程中容易受到損傷,不利于腋芽的誘導(dǎo)。5月氣溫上升,雨水充沛,利于茶樹生長,茶樹枝條達(dá)到15~20 cm,節(jié)間較長較嫩,脫分化能力強。6月份溫度繼續(xù)升高,茶樹生長較快,枝條逐漸木質(zhì)化,脫分化能力弱,不利于茶樹腋芽誘導(dǎo)。因此,5月份的茶樹枝條更有利于腋芽誘導(dǎo),且誘導(dǎo)出腋芽所需的時間短,芽的長勢也好。
從表2可知,莖段不同的放置方式對茶樹腋芽誘導(dǎo)率的影響不同。水平放置培養(yǎng)的莖段,腋芽的萌發(fā)率是83%,基部插入培養(yǎng)基培養(yǎng)的莖段,腋芽的萌發(fā)率是36%。從實驗結(jié)果可知,莖段水平放置培養(yǎng),腋芽的萌發(fā)率更高,可能的原因是材料水平放置,增加了材料與培養(yǎng)基的接觸面積,有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,材料基部插入培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方式,材料與培養(yǎng)基的接觸面積較少,材料吸收培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)少且慢,導(dǎo)致腋芽生長發(fā)育緩慢。所以將材料水平放置更有利于茶樹腋芽的誘導(dǎo)。
表2 莖段的不同放置方式對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響
實驗以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基,在含有NAA和6-BA的培養(yǎng)基上,帶芽莖段接種一周后,莖段開始膨大(圖1A);外植體培養(yǎng)20d后,切口有少量愈傷組織出現(xiàn),腋芽萌發(fā)(圖1B);培養(yǎng)40 d后,腋芽葉片開始舒展(圖1C),接種90 d后,腋芽發(fā)育成有5~6片真葉的枝條(圖1D)。由表3可以看出:MS培養(yǎng)基中,6-BA濃度為2.0 mg·L-1,NAA濃度為0.5 mg·L-1時,誘導(dǎo)率最高,為92%。因此,在MS基本培養(yǎng)基中,腋芽誘導(dǎo)的最適激素濃度配比為:6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1.在1/2MS的培養(yǎng)基中,6-BA濃度為2.0 mg·L-1,NAA濃度為0.2 mg·L-1的誘導(dǎo)率較高,為88%。因此,當(dāng)基本培養(yǎng)基為1/2MS時,腋芽誘導(dǎo)的最適濃度配比為:6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1。
表3 不同的植物激素對腋芽誘導(dǎo)的影響
目前,關(guān)于茶樹莖段組織培養(yǎng)的研究報道較少,茶樹在不同時間取材,腋芽誘導(dǎo)率有明顯差異,王樹芝[5]等研究發(fā)現(xiàn),與8月份和10月份相比,5月份取材的外植體腋芽萌動最快,萌發(fā)率最高,10月份取材的外植體腋芽萌動最慢,萌發(fā)率最低,8月份取材的外植體的腋芽萌發(fā)時間和萌發(fā)率介于5份月和10月份之間,本次實驗研究發(fā)現(xiàn)5月份莖段腋芽的誘導(dǎo)率明顯高于4月份和6月份。且5月份莖段腋芽誘導(dǎo)所需的時間也比4份月和6月份短,這與王樹芝等研究結(jié)果相似,綜上所述,在茶樹莖段腋芽誘導(dǎo)中,帶芽莖段的最佳取材時間為5月,在此期間取材培養(yǎng),腋芽誘導(dǎo)率較高。
研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中植物激素的種類和濃度會對外植體的分化能力產(chǎn)生影響,高濃度生長素會促進愈傷組織的形成,而愈傷組織的形成會降低增殖率,高濃度的細(xì)胞分裂素會抑制愈傷組織的形成,但對芽的誘導(dǎo)和生長有一定的促進作用。李家華等[6]以大葉種茶樹新梢為外植體,認(rèn)為6-BA0.5 mg·L-1+2.4-D4.0 mg·L-1促進腋芽形成單生芽的效果最好,6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1誘導(dǎo)愈傷組織形成和腋芽分化均獲得較好效果,6-BA4.0 mg·L-1對促進叢芽形成效果最好。袁正仿等[7]以藪北茶樹帶腋芽的莖段為外值體,認(rèn)為最佳腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg·L-1,芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1,在此次實驗中,培養(yǎng)基中添加的生長素是萘乙酸(NAA),細(xì)胞分裂素是6-BA,通過對比附加不同植物激素的培養(yǎng)基對腋芽誘導(dǎo)的影響,我們發(fā)現(xiàn):在MS培養(yǎng)基上,NAA和6-BA的濃度都較高時,腋芽的誘導(dǎo)率較高,說明在MS培養(yǎng)基上附加較高濃度的植物激素可以促進腋芽的誘導(dǎo);在1/2MS培養(yǎng)基上,NAA濃度較低和6-BA濃度較高時,腋芽的誘導(dǎo)率較高,而NAA和6-BA濃度都為高濃度時,腋芽誘導(dǎo)率明顯下降,說明在1/2MS培養(yǎng)基上,腋芽誘導(dǎo)所需的植物激素有一個最適濃度,超過這個濃度范圍,腋芽誘導(dǎo)率會明顯降低。以1/2MS為基本培養(yǎng)基的四種培養(yǎng)基的平均腋芽誘導(dǎo)率要稍優(yōu)于以MS為基本培養(yǎng)基的平均腋芽誘導(dǎo)率。