劉 慧,高傳玉,李海劍,李玉東,楊守忠,毛紹芬,陶雅非

1)河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科鄭州 450003 2)南陽(yáng)市中心醫(yī)院心內(nèi)科南陽(yáng) 473009 3)南陽(yáng)市中心醫(yī)院腎內(nèi)科南陽(yáng) 473009 #通訊作者,男,1962年生,博士,主任醫(yī)師,研究方向:冠心病的診斷與治療,E-mail:gaocy2000@yahoo.com.cn

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ,PPARγ)是甾體激素受體超家族的新成員,能被脂肪酸以及外源性過(guò)氧化物增殖物激活,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、脂肪細(xì)胞分化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。研究[1-3]表明,PPARγ具有整體的抗炎癥和抗動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)功能。作為臨床上廣泛應(yīng)用的血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體(AT1R)拮抗劑氯沙坦,其抗AS作用是否與PPARγ有關(guān),目前未見(jiàn)報(bào)道。作者建立了兔腹主動(dòng)脈 AS模型,觀察氯沙坦對(duì)血管成形術(shù)后PPARγ和纖溶酶原激活物抑制因子-1(p lasm inogen activator inhibitor-1,PAI-1)表達(dá)的影響,以進(jìn)一步探討氯沙坦對(duì)AS和斑塊穩(wěn)定作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 新西蘭大白兔24只,雄性,體質(zhì)量(2.5±0.3)kg,河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為普通飼料喂養(yǎng)組(G1組)、高脂飲食喂飼+動(dòng)脈內(nèi)皮損傷組(G2組)及高脂飲食喂飼+動(dòng)脈內(nèi)皮損傷+氯沙坦治療組(G3組),每組8只。

1.2 試劑及儀器 PPARγ、PAI-1一抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。球囊由Cordis公司提供。日本HMIS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)。1.3 動(dòng)物模型的建立 G1組家兔喂以普通飼料。G2、G3組家兔以含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%膽固醇的飼料飼養(yǎng)2周后行腹主動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)。參考 Block等[4]的方法并加以改進(jìn),制作腹主動(dòng)脈球囊損傷模型。術(shù)后G2、G3組繼續(xù)以高脂飲食喂養(yǎng) 6周,G3組每天加用氯沙坦(商品名科素亞,美國(guó)默沙東公司提供)10 mg/kg。

1.4 組織標(biāo)本留取 術(shù)后6周處死各組家兔,取出腹主動(dòng)脈,截取成形部位血管標(biāo)本,4 g/L多聚甲醛固定 4 h。逐級(jí)脫水,石蠟包埋,4μm厚連續(xù)切片,采用電腦圖像分析儀分別測(cè)定新生內(nèi)膜厚度(intimal thickness,IT)、中膜厚度(media thickness,MT)、內(nèi)膜面積(intimal area,IA)及中膜面積(media area, MA),計(jì)算新生內(nèi)膜厚度與中膜厚度比(IT/MT)及內(nèi)膜面積與中膜面積比(IA/MA)。

1.5 腹主動(dòng)脈PPARγ和PAI-1蛋白檢測(cè) PPARγ

及PAI-1免疫組織化學(xué)染色采用常規(guī)親和素-生物素-過(guò)氧化物酶技術(shù),具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。PPARγ、PAI-1陽(yáng)性著色均表現(xiàn)為胞質(zhì)染成淺黃色、棕黃色或棕褐色。每張切片高倍鏡下取 10個(gè)視野,計(jì)算每個(gè)視野下陽(yáng)性表達(dá)的血管平滑肌細(xì)胞占總血管平滑肌細(xì)胞的百分比,結(jié)果取平均值。

1.6 腹主動(dòng)脈PPARγ和PAI-1mRNA檢測(cè) 組織總RNA提取按Trizol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RT-PCR采用兩步法。10μg總RNA配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,25℃10min,42℃60 min,70℃10min,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板用PPARγ、PAI-1引物經(jīng)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)總體積為 25μL。引物由北京奧科公司合成。PPARγ引物序列:上游5'-CACAA GAACAAATGCCAGTA-3',下游5'-GGTCCTCAGTG GAAGAATCG-3';PAI-1引物序列:上游5'-TGG ACTTGACCACGGAGGAGC-3',下游5'-CTCGGTG CCCTTCAGTGAGCT-3';內(nèi)參照β-actin引物序列:上游5'-GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGA-3',下游5'-GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT-3'。PPARγ擴(kuò)增條件為:95℃5 min;94℃30 s,63℃50 s,72℃30 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸6min,終產(chǎn)物為521 bp。PAI-1擴(kuò)增條件為:95℃5m in;94℃30 s,59℃40 s,72℃40 s,共 35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸6 min,終產(chǎn)物為480 bp。β-actin終產(chǎn)物為332 bp。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,應(yīng)用圖文分析系統(tǒng),以目的基因片段/β-actin片段的條帶灰度值比值來(lái)表示其相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0對(duì)3組腹主動(dòng)脈IT、IT/MT比值、IA、IA/MA比值、PPARγ和PAI-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率及mRNA相對(duì)表達(dá)量行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組腹主動(dòng)脈IT、IT/M T、IA及IA/MA比值的比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3組腹主動(dòng)脈IT、IT/MT比值、IA及IA/M A的比較

2.2 3組腹主動(dòng)脈PPARγ和PAI-1蛋白的表達(dá) 結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2及表2。

表2 3組腹主動(dòng)脈PPARγ及PAI-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和m RNA相對(duì)表達(dá)量的比較

2.3 3組腹主動(dòng)脈PPARγ及PAI-1 mRNA的表達(dá) 結(jié)果見(jiàn)表2、圖3和圖4。

圖3 3組腹主動(dòng)脈PPARγm RNA的RT-PCR結(jié)果

圖4 3組腹主動(dòng)脈PAI-1m RNA的RT-PCR結(jié)果

3 討論

AS是多種病因造成的始發(fā)于動(dòng)脈壁內(nèi)膜的一系列分子和細(xì)胞改變的結(jié)果。PPAR屬Ⅱ型核受體超家族成員,可在AS斑塊處表達(dá),在AS有關(guān)的脂質(zhì)代謝和血管炎癥中起關(guān)鍵作用[3]。該研究中,兔腹主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后,局部PPARγ表達(dá)增加,提示內(nèi)皮損傷可以刺激 PPARγ過(guò)度表達(dá)。在相應(yīng)配體的作用下, PPAR可以下調(diào)某些致病基因的表達(dá)。研究[5]表明, PPARγ激動(dòng)劑能夠通過(guò)抗炎、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及穩(wěn)定斑塊等多種途徑,從整體上發(fā)揮抗AS作用。

近年發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(ARB)除了降壓以外,還具有抗纖維化、抗卒中、降尿酸、抗房顫(AF)、治療舒張期心力衰竭及抗AS等[6]多種作用。其中僅有替米沙坦被證實(shí)是PPARγ的一種部分激動(dòng)劑,通過(guò)激活PPARγ發(fā)揮抗AS作用[7]。而目前廣泛應(yīng)用的氯沙坦的抗 AS作用是否與PPARγ有關(guān),尚未見(jiàn)報(bào)道。

PAI-1是體內(nèi)最重要的纖溶活性調(diào)節(jié)劑,調(diào)節(jié)纖溶平衡[8]。PAI-1致AS的主要機(jī)制是阻止纖溶酶形成及細(xì)胞外基質(zhì)的降解,調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移,有助于形成阻塞性斑塊而導(dǎo)致臨床事件發(fā)生。該研究中,球囊拉傷動(dòng)脈導(dǎo)致PAI-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞過(guò)度表達(dá)。PAI-1異常表達(dá)所致的細(xì)胞表面纖溶活性降低可引起或加重血栓形成。

總之,該研究建立了兔腹主動(dòng)脈 AS模型,觀察氯沙坦對(duì)血管成形術(shù)后PPARγ和PAI-1表達(dá)的影響。結(jié)果表明,兔腹主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷,發(fā)生 AS后,局部 PAI-1表達(dá)異常升高,與國(guó)外相關(guān)研究[9]一致,給予氯沙坦干預(yù)后明顯下降,同時(shí) PPARγ表達(dá)增加。有研究[10]表明,PPARγ激活后可以抑制PAI-1表達(dá)。該研究結(jié)果表明,氯沙坦抑制PAI-1表達(dá),抗AI,可能與激活PPARγ有關(guān),但其具體機(jī)制及信號(hào)途徑有待進(jìn)一步研究。

[1]Duan SZ,UsherMG,Mortensen RM.Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-mediated effects in the vasculature[J].Circ Res,2008,102(3):283

[2]Jiang Q,Heneka M,Land reth GE.The role of peroxisome proliferator-activated recep tor-gamma(PPARgamma)in Alzheimer's disease:therapeutic imp lications[J].CNS Drugs,2008,22(1):1

[3]Kuusisto J,Andrulionyte L,Laakso M.Atherosclerosis and cardiovascular risk reduction with PPAR agonists[J]. Curr Atheroscler Rep,2007,9(4):274

[4]Block PC,Baughman KL,Pasternak RC,et al.Transluminal angioplasty:correlation ofmorphologic and angiographic findings in an experimentalmodel[J].Circulation,1980,61(4):778

[5]Staels B.PPAR agonists and themetabolic syndrome[J]. Therapie,2007,62(4):319

[6]Yu Y,Fukuda N,Yao EH,etal.Effects ofan ARB on endothelial progenitor cell function and cardiovascu lar oxidation in hypertension[J].Am JHypertens,2008,21(1):72

[7]Imayama I,Ichiki T,Inanaga K,et al.Telmisartan downregulates angiotensinⅡtype 1 receptor through activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma[J]. Cardiovasc Res,2006,72(1):184

[8]Aleksic N,Wang YW,Ahn C,etal.Assessmentof coronary heartdisease risk by combined analysis of coagulation factors[J].Atherosclerosis,2008,198(2):294

[9]Brown NJ,Brad ford J,Wang Z,et al.Modu lation of angiotensinⅡand norepinephrine-induced plasminogen activator inhibitor-1 exp ression by AT1a receptor deficiency [J].Kidney Int,2007,72(1):72

[10]Boyle PJ.Diabetes mellitus and macrovascular disease: mechanisms and mediators[J].Am J Med,2007,120(9 Suppl 2):S12