張連富, 張環(huán)偉

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無(wú)錫214122;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫214122)

番茄紅素(Lycopene)是一種由11個(gè)共軛雙鍵和2個(gè)非共軛雙鍵組成的直鏈型多不飽和烯烴,分子式C40H56。由于番茄紅素分子中含有的雙鍵數(shù)目較多,分子不能內(nèi)旋轉(zhuǎn)、剛性較強(qiáng),所以比較容易受光、熱、氧、酸等因素的影響而產(chǎn)生空間異構(gòu)體[1-2]。目前的研究發(fā)現(xiàn),食物中(如番茄醬中)天然存在的番茄紅素以全反式結(jié)構(gòu)為主(90%～98%),而人體的血清和腎上腺等組織中含有的番茄紅素主要是以順式結(jié)構(gòu)為主(79%～88%)——膳食與人體組織中番茄紅素空間構(gòu)型的差異性提示我們:順式結(jié)構(gòu)的番茄紅素可能更有利于被人體吸收,如果對(duì)含番茄紅素食物原料進(jìn)行處理并提高其中順式結(jié)構(gòu)比例,就有可能提高產(chǎn)品的生物價(jià)并在此基礎(chǔ)上大幅提高其生物活性作用[3]。為了弄清上述問(wèn)題,就必須獲得人體中常見(jiàn)番茄紅素空間異構(gòu)體的單體并進(jìn)行體內(nèi)、體外試驗(yàn)研究,而實(shí)現(xiàn)番茄紅素不同異構(gòu)體的分離是實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的首要前提。為此,作者本文即對(duì) HPLC分離番茄紅素異構(gòu)體這種方法進(jìn)行研究。

由于番茄紅素各異構(gòu)體間在極性、分子大小等方面差異很小(圖1),要實(shí)現(xiàn)他們之間的分離比較困難。目前國(guó)內(nèi)外普遍采用的分離方法是高效液相色譜法,主要有兩種方式:一種是采用C30柱來(lái)分離,但C30柱對(duì)分離不同類胡蘿卜素效果較好,對(duì)番茄紅素的順?lè)串悩?gòu)體的分離效果則不是很理想[4-6];另一種是Schierle J等建立的利用3根Nucleosil 300-5正相色譜柱聯(lián)用的方法對(duì)番茄紅素的異構(gòu)體進(jìn)行分離,這種方法實(shí)現(xiàn)了順?lè)串悩?gòu)體的分離,但對(duì)順式異構(gòu)體間的分離效果也不十分理想。而且,3根色譜柱聯(lián)用在實(shí)際操作中也有很大的麻煩,需要長(zhǎng)時(shí)間的平衡操作才能使色譜柱達(dá)到平衡狀態(tài)[7]。

鑒于目前所采用的色譜柱都存在一定的缺點(diǎn),作者嘗試?yán)肅osmosil Cholester色譜柱來(lái)實(shí)現(xiàn)番茄紅素各異構(gòu)體之間的分離:Cosmosil Cholester柱是Nacalai Tesque Inc.開(kāi)發(fā)的反相體系的HPLC柱,采用膽甾醇鍵合硅膠填料,具有與傳統(tǒng)的烷基鍵合C18、C30硅膠填料一樣的疏水性,因而其對(duì)功能基的選擇能力幾乎相同;但在分子形狀特別是空間立體異構(gòu)體的識(shí)別能力上Cholester柱的性能非常高。 等利用此種色譜柱對(duì)ceriporic acid異構(gòu)體進(jìn)行了分離,取得了較好的分離效果[8]?？紤]到ceriporic acid異構(gòu)體分離與番茄紅素空間異構(gòu)體的分離具有一定程度的相似性(圖2),作者對(duì)Cosmosil Cholester-HPLC體系分離番茄紅素空間異構(gòu)體進(jìn)行了嘗試。

圖1 番茄紅素的幾種常見(jiàn)的順?lè)串悩?gòu)體Fig.1 Structure of the all-trans/cis-isomers of lycopene

圖2 Ceriporic acid結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Structrure of Ceriporic acid isomers

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

全反式番茄紅素(純度90%):華北制藥股份有限公司產(chǎn)品。

乙腈:AP,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;四氫呋喃:AP,上海試四赫維化工有限公司產(chǎn)品;乙酸乙酯:AP,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)儀器

UV-2102 PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);高效液相色譜儀Ⅰ(P3000型高壓輸液泵,UV3000可變波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)分光檢測(cè)器):北京創(chuàng)新通恒科技有限公司產(chǎn)品;高效液相色譜儀 Ⅱ(Waters 2695型HPLC,Waters 996二極管陣列檢測(cè)器;Masslynx工作站);色譜柱:Cosmosil Cholester柱(4.6 mm×250 mm,5μm)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 異構(gòu)化番茄紅素樣品的制備 參照Pierre Lambelet等[9]的方法進(jìn)行順式化處理:稱取0.020 0 g的番茄紅素溶于100 mL乙酸乙酯中熱回流24 h。通過(guò)對(duì)反應(yīng)前后的樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,出現(xiàn)了文獻(xiàn)中報(bào)道的362 nm處的順式峰(圖3)。說(shuō)明此樣品中已經(jīng)含有了順式異構(gòu)體,可以用于分離,摸索試驗(yàn)條件。

圖3 反應(yīng)前后的全波長(zhǎng)掃描圖譜Fig.3 UV-Visible spectra of lycopene samples before and after isomerization

1.3.2 檢測(cè)方法 對(duì)反應(yīng)前后的樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,確定樣品中含有番茄紅素順式異構(gòu)體;用高效液相色譜儀Ⅰ對(duì)流動(dòng)相比例、進(jìn)樣量、流速等試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,將出峰個(gè)數(shù)、分離度R及峰形等3個(gè)指標(biāo)作為分離效果的判斷標(biāo)準(zhǔn),得出最佳分離條件;用高效液相色譜儀Ⅱ進(jìn)行不同儀器間的重復(fù)性試驗(yàn)。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

綜合考慮各種試劑的性質(zhì)和對(duì)番茄紅素的溶解性性質(zhì),選取的試驗(yàn)溶劑為四氫呋喃、乙酸乙酯與乙腈。選取的兩種流動(dòng)相為:A)乙酸乙酯:乙腈,B)四氫呋喃(THF):乙腈。

從色譜圖中可以看出,兩種流動(dòng)相在相同的配比條件下均對(duì)樣品中的物質(zhì)達(dá)到了分離的目的,分離出的峰的個(gè)數(shù)也相同。對(duì)各峰的分離程度和峰形等方面來(lái)看,結(jié)果也大致相同,采用流動(dòng)相A的分離度(Rmin=1.7)要稍好于用流動(dòng)相B(Rmin=1.3)。但是從保留時(shí)間來(lái)看,用A為流動(dòng)相的保留時(shí)間(tR=68 min)明顯長(zhǎng)于B(tR=42 min),這樣造成了分離成本的增加,所以試驗(yàn)采用四氫呋喃和乙腈作為流動(dòng)相。

圖4 不同流動(dòng)相條件下分離樣品的色譜圖Fig.4 Chromatograms of isomerized lycopene using different mobile phase

2.2 流動(dòng)相比例的確定

由上步選取流動(dòng)相后,選擇不同比例的流動(dòng)相來(lái)進(jìn)行試驗(yàn),采取V(THF)∶V(乙腈)=25∶75、10∶90、5∶95 3個(gè)比例來(lái)進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果如圖5。

圖5 不同流動(dòng)相比例下分離樣品的色譜圖Fig.5 Chromatograms of isomerized lycopene using different mobile phase ratio

由上圖可知,隨著流動(dòng)相中極性物質(zhì)乙腈含量的增加,番茄紅素異構(gòu)體的分離效果越好。在V(THF)∶V(乙腈)=25∶75時(shí),只分出了3個(gè)峰。當(dāng)兩者的比例達(dá)到10∶90時(shí),可以分出5個(gè)峰,分離效果較好。但是當(dāng)兩者的比例達(dá)到5∶95時(shí),分離效果與10∶90相似,但保留時(shí)間幾乎延長(zhǎng)了一倍。流動(dòng)相比例采用10:90的比例來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3 流動(dòng)相流速的確定

流動(dòng)相的流速對(duì)番茄紅素異構(gòu)體分離效果有一定的影響,根據(jù)本試驗(yàn)所采用的儀器的性質(zhì)和承載能力,采用的流量為 1.4、1.0、0.6 mL/min 3個(gè)梯度。

流動(dòng)相的流速對(duì)峰的分離效果的影響并不是十分明顯(圖6)。當(dāng)流量低時(shí),分離效果稍好,但保留時(shí)間太長(zhǎng),減短了儀器的使用壽命。當(dāng)流量增大時(shí),泵的壓力過(guò)大,對(duì)儀器的損害也是很大的。采用了比較常用的流量1 mL/min。

2.4 進(jìn)樣量的確定

研究了進(jìn)樣量對(duì)番茄紅素異構(gòu)體分離效果的影響,由于進(jìn)樣閥的最大容積(20μL)的限制,所以采用的進(jìn)樣量為20μL和10μL。

圖6 流動(dòng)相不同流速分離樣品的色譜圖Fig.6 Chromatograms of isomerized lycopene using different mobile phase flowrate

試驗(yàn)結(jié)果表明(圖7),在進(jìn)樣量為20μL時(shí),分離度和10μL進(jìn)樣的結(jié)果沒(méi)有大的區(qū)別。采用高效液相色譜儀Ⅱ檢測(cè)的30μL進(jìn)樣,分離度小于20 μL進(jìn)樣,由于樣品量太大,柱子的載量有一定的限度,流動(dòng)相在沒(méi)有將前種物質(zhì)完全洗脫出來(lái)的時(shí)候,后種物質(zhì)已經(jīng)溶解于流動(dòng)相中被洗脫出來(lái),所以若進(jìn)樣量過(guò)大,分離效果不是很好。采用的10 μL和20μL進(jìn)樣對(duì)分離效果無(wú)明顯影響,則采用20μL的進(jìn)樣量將有利于試驗(yàn)效率的提高。

圖7 不同進(jìn)樣量下分離樣品的色譜圖Fig.7 Chromatograms of isomerized lycopene under different sample injection

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

為了檢測(cè)試驗(yàn)條件的可靠性,在以上試驗(yàn)確定的試驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上,進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。圖8為高效液相色譜儀Ⅰ分離的色譜圖。同時(shí),進(jìn)行了不同儀器間的驗(yàn)證性試驗(yàn),采用高效液相色譜儀Ⅱ?qū)悠愤M(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),得到的試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。

圖8 高效液相色譜儀Ⅰ分離的色譜圖Fig.8 Chromatogram of sample using HPLC I

圖9 高效液相色譜儀Ⅱ分離的色譜圖Fig.9 Chromatogram of sample using HPLC Ⅱ

從上面兩張色譜圖可以看出,作者所確定的試驗(yàn)條件對(duì)樣品中的組分實(shí)現(xiàn)了分離。對(duì)分出的組分進(jìn)行初步鑒定,從全波長(zhǎng)掃描圖得出以上5個(gè)峰為同類型物質(zhì),可以認(rèn)定為番茄紅素的異構(gòu)體。所以,此試驗(yàn)條件可以用于番茄紅素異構(gòu)體的分離。與Pierre Lambelet等[9]所采用的3根正相柱聯(lián)用的方法相比,在對(duì)樣品進(jìn)行了同樣的處理后進(jìn)行分離,分離到了5個(gè)色譜峰,而且最小分離度也達(dá)到了1.3,基本可以將各個(gè)峰分開(kāi),并且此方法操作簡(jiǎn)便,平衡時(shí)間短。而3根正相柱聯(lián)用的方法只分出了4個(gè)色譜峰,操作較復(fù)雜。所以本試驗(yàn)基本達(dá)到預(yù)期效果。

在所確定的測(cè)定條件下,異構(gòu)化處理前番茄紅素樣品(全反式)的色譜圖及其中主要組分(全反式番茄紅素,響應(yīng)時(shí)間為33.95 min)的UV-Vis光譜如圖10、11所示。對(duì)比處理后的色譜圖可知,所確定的番茄紅素異構(gòu)體分離條件適當(dāng),操作穩(wěn)定,重現(xiàn)性良好。

圖10 標(biāo)準(zhǔn)番茄紅素樣品的液相色譜圖Fig.10 Chromatogram of standard all-trans lycopene sample

圖11 標(biāo)準(zhǔn)番茄紅素樣品的 UV-Vis光譜圖Fig.11 UV-Visible spectra of satandard all-trans lycopene sample

3 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)對(duì)Cosmosil Cholester柱分離番茄紅素異構(gòu)體的條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn),得到了一種可以較好分離番茄紅素異構(gòu)體的方法,并確定了分離條件為:流動(dòng)相為V(四氫呋喃)∶V(乙腈)=10∶90,進(jìn)樣量20μL,流量1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)472 nm。并在此試驗(yàn)條件下進(jìn)行了重復(fù)性試驗(yàn),證明了此方法的重現(xiàn)性較好。與Schierle J等建立的3根Nucleosil 300-5正相色譜柱聯(lián)用法[7]相比,作者所使用的方法操作簡(jiǎn)便,避免了由于3柱串聯(lián)所造成的漂移,易于實(shí)現(xiàn)色譜柱的平衡;與C30柱法[4-6]相比,本方法對(duì)各順式峰的分離效果更好些,分離效果基本達(dá)到完全分離要求。

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