賀松, 龔芳紅, 張德純＊, 劉明方, 程芳, 郭亞楠

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心,重慶400016;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,陜西西安710061)

乳酸菌是食品安全性微生物,利用乳酸菌表達(dá)重要的醫(yī)藥功能蛋白以賦予乳酸菌新的生理功能,是開發(fā)乳酸菌應(yīng)用的新領(lǐng)域[1]。但是目前構(gòu)建的重組乳酸菌多經(jīng)過了遺傳修飾,帶有抗生素抗性標(biāo)記,這些抗生素抗性基因若投放到環(huán)境中或人和動(dòng)物體內(nèi),由于抗性因子的轉(zhuǎn)移,會(huì)存在嚴(yán)重的生物安全隱患,因此在應(yīng)用中也將受到限制。食品級(jí)載體系統(tǒng)的研究為重組乳酸菌的潛在應(yīng)用提供了可能。目前國(guó)內(nèi)外已有許多關(guān)于食品級(jí)篩選標(biāo)記研究的報(bào)道,包括細(xì)菌素抗性及免疫性標(biāo)記[2-3]、重金屬抗性標(biāo)記[4]、噬菌體抗性標(biāo)記[5]、營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)標(biāo)記[6-8]和糖類利用篩選標(biāo)記[9]等。作者借鑒藍(lán)白篩選轉(zhuǎn)化子的思路,從嗜酸乳桿菌中克隆β-半乳糖苷酶(lacZ)基因,利用X-gal顯色篩選大腸桿菌和乳酸乳球菌中的陽性克隆子,并觀察以lacZ基因作為食品級(jí)篩選標(biāo)記的篩選效果和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 嗜酸乳桿菌(L.acidophilusATCC4356):購自中國(guó)科學(xué)院微生物所菌種保藏中心;乳酸乳球菌(L.lactisMG1363)和質(zhì)粒pMG36e:由荷蘭 Groningen University J.Kok博士惠贈(zèng);大腸桿菌(E.coliDH5α):作者所在實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.1.2 主要試劑 M17培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基購自O(shè)xoid公司;DNA回收試劑盒:購自O(shè)mega公司;基因組提取試劑盒,質(zhì)粒抽提試劑盒,限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ和PstⅠ:均為 Promega公司產(chǎn)品;PCR及連接相關(guān)試劑:均購自 Takara公司;X-gal和ONPG:Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 含有l(wèi)acZ基因重組體的構(gòu)建 根據(jù) Gen-Bank公布的嗜酸乳桿菌ATCC4356β-半乳糖苷酶(lacZ)基因序列(2 017 bp,編號(hào):EU590652)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。

以嗜酸乳桿菌ATCC4356染色體DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得lacZ基因。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s,55℃退火30 s,72℃延伸130 s,共26個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物切膠回收,回收產(chǎn)物與質(zhì)粒pMG36e同步進(jìn)行XbaⅠ和PstⅠ雙酶切回收處理。之后兩者在 T4 DNA連接酶作用下連接,構(gòu)建的重組質(zhì)粒名為pMG36e-lacZ。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化菌涂布于LB-Ery-X-gal平板(含200μg/mL紅霉素,臨用前2小時(shí)吸取X-gal DM F溶液50μL涂布平板)表面,37℃培養(yǎng)18～24 h,挑取藍(lán)色菌落(命名為DH5α/pMG36e-lacZ)進(jìn)行傳代培養(yǎng),并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行 PCR、酶切和測(cè)序鑒定(由 Invitrogen公司進(jìn)行)。

1.2.2 重組體電轉(zhuǎn)乳酸乳球菌MG1363

1)重組質(zhì)粒的提取:大腸桿菌陽性轉(zhuǎn)化子DH5α/pMG36e-lacZ接種于 LB-Ery-X-gal平板(紅霉素終質(zhì)量濃度增加為250μg/mL,其他同前),挑取藍(lán)色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(紅霉素終質(zhì)量濃度為250μg/mL),37℃振蕩培養(yǎng)過夜,并用質(zhì)粒抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ。

2)乳酸乳球菌MG1363感受態(tài)細(xì)胞制備:接種MG1363于M17肉湯培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)至OD600為0.5～0.8,在結(jié)束培養(yǎng)之前1小時(shí)加入氨芐青霉素至終質(zhì)量濃度為20μg/mL。培養(yǎng)結(jié)束后將細(xì)菌培養(yǎng)物冰浴5 min,離心收集菌體,用冰冷的甘油緩沖液(100 mg/mL甘油,0.5 mmol/L蔗糖)洗滌菌體5次,然后用1∶100的甘油緩沖液重懸菌體。

3)電穿孔轉(zhuǎn)化MG1363:參見文獻(xiàn)[10]。電穿孔條件:電壓為2 kV,時(shí)間為5 ms。電轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于 M17-LSCaMg-Ery-X-gal平板(含 0.5 g/dL乳糖、0.3 mol/L 蔗糖、20 mmol/L MgCl2、2 mmol/L CaCl2、5 mg/L紅霉素,臨用前2小時(shí)吸取X-gal DM F溶液50μL涂布平板),30℃培養(yǎng)48～72 h,篩選藍(lán)色菌落即為陽性重組菌,記為MG1363/pMG36e-lacZ。

1.2.3 重組菌β-半乳糖苷酶的表達(dá) 將重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-lacZ接種于10 mL LM17-Ery肉湯培養(yǎng)基(含0.5 g/dL乳糖、5 mg/L紅霉素),在30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取5 mL細(xì)菌培養(yǎng)液,離心收集菌體用500μL雙蒸水充分重懸菌體,在冰上超聲破碎菌體,然后離心收集上清液。超聲沉淀用少量水重懸后與超聲上清液、菌液一并做10 g/dL SDS-PAGE和 native-PAGE電泳分析。其中SDS-PAGE電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色;native-PAGE電泳后的凝膠鋪在涂有100μL濃度為2 g/dL的X-gal溶液的M17平板上,30℃孵育2 h,藍(lán)色條帶顯示β-半乳糖苷酶的存在。

1.2.4lacZ基因作為篩選標(biāo)記的活性及穩(wěn)定性檢測(cè) 重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-lacZ分別在LM17-X-gal平板(含0.5 g/dL乳糖,臨用前2 h吸取X-gal DM F溶液50μL涂布平板)和 M17-Ery平板(5 mg/L紅霉素)上傳60代。分別將兩種平板上第1代和第60代的細(xì)菌接種于LM17肉湯(含0.5 g/dL乳糖),30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。離心濃縮菌液并用培養(yǎng)菌液重懸菌體,在冰上超聲破碎菌體,離心收集超聲上清液,采用鄰硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)法[11]測(cè)定β-半乳糖苷酶活性,結(jié)合Bradford法[12]計(jì)算β-半乳糖苷酶比活力,并對(duì)在 LM17-X-gal平板傳 60代的MG1363/pMG36e-lacZ提質(zhì)粒鑒定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

首先對(duì)重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ進(jìn)行 PCR鑒定,1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳顯示在約2 000 bp處有一明顯條帶(圖1a)。再對(duì)重組質(zhì)粒分別進(jìn)行XbaⅠ、PstⅠ單酶切和雙酶切鑒定(圖1b),鑒定結(jié)果與預(yù)期目標(biāo)一致。測(cè)序結(jié)果表明,pMG36e-lacZ中的lacZ基因序列與 GenBank中公布的序列符合率達(dá)97%。由此可見,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 β-半乳糖苷酶的表達(dá)

重組菌株 DH5α/pMG36e-lacZ和 MG1363/pMG36e-lacZ在篩選平板上長(zhǎng)出了藍(lán)色菌落,初步說明能表達(dá)有活性的β-半乳糖苷酶。SDS-PAGE分析見圖2。重組菌株在約70 000處可見一明顯的表達(dá)條帶,與天然lacZ的理論相對(duì)分子質(zhì)量76 583相近。Native-PAGE分析結(jié)果見圖3。菌液、超聲上清液和超聲菌體都具有β-半乳糖苷酶活性。

圖1 重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ鑒定1Fig.1 Identification of recombinant plasmid(1)

圖2 SDS-PAG圖顯示重組菌株 MG1363/pMG36elacZ.分泌β-半乳糖苷酶Fig.2 The SDS-PAGE analysis ofβ-galactosidase secreted by recombinant strain MG 1363/pMG 36e-lacZ

圖3 重組菌株 MG1363/pMG36e-lacZ native-PAGE X-gal染色圖Fig.3 The native-PAGE figure of recombinant strain MG1363/pMG36e-lacZ stained with X-gal

2.3 lacZ基因作為篩選標(biāo)記的活性及穩(wěn)定性檢測(cè)

分別對(duì)紅霉素和X-gal兩種篩選方法篩選的第2代和第61代重組菌株MG1363/pMG36e-lacZ進(jìn)行酶活和比活力測(cè)定,結(jié)果見表1。結(jié)果顯示,在利用X-gal篩選60代后的重組菌株β-半乳糖苷酶比活力與第2代相比沒有顯著差異(P=0.592>0.05);與利用紅霉素篩選60代后的重組菌株β-半乳糖苷酶比活力相比也沒有顯著差異(P=0.882>0.05),表明lacZ基因作為篩選標(biāo)記具有較好的活性和穩(wěn)定性。對(duì)X-gal篩選第60代的重組菌株提質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定結(jié)果也表明該基因具有較好的穩(wěn)定性,見圖4。

表1 第2代和第61代重組菌株進(jìn)行酶活和比活力測(cè)定Tab.1 β-galactosidase activity and specific activity of MG1363/pMG36e-lacZat t＊he 2nd generation and the 61st generation respectively

表中數(shù)據(jù)為檢測(cè)8次所得的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。＊X-gal篩選60代后的重組菌株β-半乳糖苷酶比活力與第2代相比,P>0.05?！鱔-gal篩選60代后的重組菌株β-半乳糖苷酶比活力與紅霉素篩選60代后的重組菌株相比,P>0.05。

圖4 重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ鑒定2Fig.4 Identification of recombinant plasmid(2)

3 結(jié) 語

β-半乳糖苷酶的主要功能是降解乳糖和合成低聚半乳糖,對(duì)生物無害,而且在生物利用碳水化合物營(yíng)養(yǎng)中起著重要作用。它可以水解底物X-gal,呈現(xiàn)出藍(lán)色,易于檢測(cè)和觀察,若將此基因作為篩選標(biāo)記,通過檢測(cè)藍(lán)色菌落的形成即可成功篩選出陽性克隆子[13]。最為成功的應(yīng)用就以pUC系列克隆載體為基礎(chǔ)的藍(lán)—白篩選系統(tǒng),這一篩選系統(tǒng)利用了β-半乳糖苷酶基因的負(fù)性篩選特性。事實(shí)上,同樣可以應(yīng)用β-半乳糖苷酶基因編碼產(chǎn)物的正性篩選方法也同樣可以獲得陽性克隆子。嗜酸乳桿菌是我們所熟悉的重要的益生菌,主要存在于酸奶等乳制品和人胃腸道中,對(duì)維持人體健康有益,甚至對(duì)一些消化道疾病有治療作用[14]。最近嗜酸乳桿菌基因組被測(cè)序(GenBank No:CP000033)[15],發(fā)現(xiàn)基因組上有一個(gè)不同于大腸桿菌乳糖操縱子的lac基因簇。特別是該基因簇除擁有一個(gè)GHF-2β-半乳糖苷酶編碼基因 lacLM外,還擁有一個(gè)GHF-42β-半乳糖苷酶基因lacZ。目前實(shí)驗(yàn)所用的篩選標(biāo)記主要是還有紅霉素抗性基因的,作者基于食品級(jí)載體的要求,從嗜酸乳桿菌ATCC4356中克隆lacZ基因,并觀察其作為食品級(jí)篩選標(biāo)記的活性和篩選穩(wěn)定性。

作者借助載體pMG36e上的 P32啟動(dòng)子和嗜酸乳桿菌 ATCC4356lacZ基因的 RBS序列(TAGAGG),在乳酸乳球菌MG1363中成功表達(dá)了β-半乳糖苷酶,并通過該酶活性成功篩選出了陽性克隆子。通過對(duì)分別采用X-gal篩選和紅霉素篩選兩種方法傳60代后的酶活分析表明,以β-半乳糖苷酶(lacZ)基因作為篩選標(biāo)記,能夠使載體在宿主菌中穩(wěn)定遺傳。因此,嗜酸乳桿菌ATCC4356lacZ基因可以作為一個(gè)新的食品級(jí)篩選標(biāo)記應(yīng)用于食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)。若將此食品級(jí)載體基因?qū)肴樗崛榍蚓?這種重組基因工程菌將是集菌體本身和有益基因于一體,制成活菌制劑被人利用則是安全方便的。

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