陳若雯, 李里, 段家彩, 盧 琪, 高 麗, 潘思軼

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢430070)

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外常滲于培養(yǎng)基的一類糖類化合物[1],除了對(duì)細(xì)菌自身具有生物學(xué)意義,它還賦予發(fā)酵乳制品特殊的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味,因而廣泛用于各種食品的增稠、穩(wěn)定、乳化、膠凝及持水。近年來,歐美及日本一些學(xué)者對(duì)LAB的大量研究表明,LAB在抗變異原性、防癌抗癌和增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面有著不可低估的作用[2],而它營養(yǎng)保健特性主要是通過其代謝過程中形成的胞外多糖物質(zhì)來完成的[3]。

乳酸菌胞外多糖是微生物適應(yīng)環(huán)境的產(chǎn)物[4],但產(chǎn)量低,菌株穩(wěn)定性差,提取成本高,制約著大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)[5]。除與菌種的遺傳特性有密切關(guān)系外,培養(yǎng)基的成份(碳源和氮源)和生長環(huán)境(溫度、p H、培養(yǎng)時(shí)間)等都會(huì)直接影響乳酸菌胞外多糖的分泌積累[1],且不同營養(yǎng)條件和環(huán)境條件下產(chǎn)生的多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能也有差異[6-8]。所以發(fā)酵條件的優(yōu)化,主要包括培養(yǎng)基的優(yōu)化和生長環(huán)境變量的優(yōu)化。

作者在確定乳酸乳桿菌最適目的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,采用SAS8.0中的 Plackett-Burman設(shè)計(jì)從發(fā)酵條件各變量找出對(duì)產(chǎn)量影響最大的因素[9-10],再以顯著因子進(jìn)行中心組合試驗(yàn)(CCD)[11],進(jìn)行進(jìn)一步的量的優(yōu)化,確定穩(wěn)定點(diǎn)的位置,得到最佳的發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種、試劑及培養(yǎng)基 乳酸乳桿菌(來自酸奶):由作者所在研究室分離、鑒定并保藏;透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000);基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MRS)、M17培養(yǎng)基、APT培養(yǎng)基、SL培養(yǎng)基、EliKer培養(yǎng)基、TJA培養(yǎng)基。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 高速冷凍離心機(jī)(64RL):美國Beckman公司生產(chǎn);紫外分光光度計(jì)(UV-6401):上海光譜儀器廠生產(chǎn);p H計(jì)上海安亭電子儀器廠生產(chǎn);全溫振蕩培養(yǎng)箱:太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EPS的提取和測定 活化菌種按體積分?jǐn)?shù)1%接種于20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37℃下培養(yǎng)24 h,將發(fā)酵液在4℃、12 000 r/min的條件下冷凍離心15 min,取上清液并棄去菌體沉淀。上清液和酒精按照1∶3的體積比于4℃條件下沉淀24 h,再次在4℃、12 000 r/min的條件下冷凍離心15 min,取沉淀利用蒸餾水復(fù)溶,透析過夜,定容得到粗多糖液[12]。以硫酸-苯酚法在490 nm下比色測定質(zhì)量濃度[13]。

1.2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用N=16的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)培養(yǎng)基的成分和菌株生長條件等各變量進(jìn)行考察[15],實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼見表1。

表中自變量編碼方程為:xi=(Xi-X0)/ΔXi,式中,Xi為自變量編碼值;X0為自變量實(shí)驗(yàn)水平中心點(diǎn)實(shí)際值;ΔXi為單變量增量[16-18]。

表1 Plackett–Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Tab.1 Coded factors and levels in Plackett-Burman design

1.2.3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì) 結(jié)合顯著因子單因素的結(jié)果,選擇下一步試驗(yàn)水平的中心點(diǎn)和各水平的步長以及顯著因子的水平,中心組合試驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)[19]見表2,試驗(yàn)的設(shè)計(jì)[20-21]見表3。

表2 試驗(yàn)因素與水平Tab.2 Factors and levels

表3 中心組合設(shè)計(jì)矩陣及試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Design and experimental results of of the central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)胞外多糖最適發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

在6種供試培養(yǎng)基中乳酸乳桿菌生長生物量、產(chǎn)酸及 EPS產(chǎn)量見表4。結(jié)果表明,MRS、APT、Eliker都較適合該菌株生長,MRS、Eliker的產(chǎn)量較高,但從材料易得及組分相對(duì)簡單考慮,選擇 Eliker作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)乳酸乳桿菌生長的影響Tab.4 Effect of different media onLactobacillus lactisfermentation

2.2 影響胞外多糖產(chǎn)量顯著因素的篩選

對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表5。對(duì)乳酸乳桿菌產(chǎn)胞外多糖影響顯著的因子有酵母粉(P<0.001)、初始 p H值(p H=0.036 0)和時(shí)間(P=0.004 7)。根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)(見表6),通過逐步回歸分析獲得最優(yōu)多元一次回歸方程為:Y=2.18 77+0.787 1x2+0.194 5x11-0.407 7x14式中Y為 EPS的預(yù)測值,由自變量編碼方程可知:x2=(X2-25)/5,x11=(X11-5.5)/0.5;x14=(X14-36)/12。

表5 回歸模型方差分析表Tab.5 Analysis of variance for the regression equation

表6 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Tab.6 Significance of the regression coefficients

2.3 顯著因子添加水平的研究

為了尋找合適的中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)和大幅度減少試驗(yàn)工作量,采用單次單因子試驗(yàn),對(duì)顯著因子的添加水平進(jìn)行研究[22-23]。因此,采用酵母粉0.3 g/L,初始p H值為6,時(shí)間為23 h為中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn),結(jié)果見圖1。

圖1 酵母粉、初始 pH值、時(shí)間對(duì)胞外多糖生產(chǎn)的影響Fig.1 Effect of yeast extract、he initial pHand fermentation time on exopolysaccharide

2.4 中心組合試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 多元二次模型的建立以及回歸分析檢驗(yàn)確定了酵母粉質(zhì)量濃度、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間的添加水平,按照中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),具體試驗(yàn)方案及EPS質(zhì)量濃度Y的測定結(jié)果見表7,得到二次響應(yīng)面回歸方程為:Y=3.699 355+0.578 7A-0.101 0B+0.155 1C-0.367 1A2-0.060 9AB-0.044 9AC-0.306 6B2-0.033 4B C-0.217 2C2。式中,Y為EPS產(chǎn)量,A為酵母粉,B為初始p H值,C為發(fā)酵時(shí)間。

由方差分析可知,實(shí)驗(yàn)所選用的模型顯著(P=0.0001),預(yù)測值和實(shí)測值之間有高相關(guān)性(R2=0.982 1),能對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行較好的擬和,因此該模型可用于預(yù)測菌株的實(shí)際發(fā)酵。從表8可以看出,在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平范圍內(nèi),A、A2、B2、C2對(duì) EPS產(chǎn)量的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01),B、C的影響達(dá)顯著水平(P<0.05),而AB、A C、B C項(xiàng)對(duì) EPS產(chǎn)量不顯著,從而確定出優(yōu)化的回歸方程:Y=3.699 355+0.578 7A-0.101 0B+0.155 1C-0.367 1A2-0.306 6B2-0.217 1C2。

表7 二次多項(xiàng)回歸模型方程方差分析結(jié)果Tab.7 ANOVA results for exopolysaccharide obtained from CCD

表8 模型的系數(shù)顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果Tab.8 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

2.4.2 EPS響應(yīng)面分析 響應(yīng)值Y在試驗(yàn)區(qū)域中有個(gè)穩(wěn)定點(diǎn)(0.470 7,-0.154 2,0.175 6),代入回歸方程Y=3.964 g/L。從圖2～4可知,由響應(yīng)面值的變化和等高線圖的趨勢,分析穩(wěn)定值的性質(zhì),確定該穩(wěn)定點(diǎn)為極大值點(diǎn)[11],從而確定最佳發(fā)酵條件為:酵母粉質(zhì)量濃度 17.35 g/L,初始 p H值5.85,發(fā)酵時(shí)間為23.18 h。在預(yù)測發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),得到實(shí)際產(chǎn)量為3.910 g/L。

圖2 酵母粉和初始pH值交互影響EPS產(chǎn)量的曲面圖及其等高線圖Fig.2 Three-dimensional plot and corresponding contour plot of EPS vs.yeast extract and the initial pH

圖3 初始pH值和發(fā)酵時(shí)間交互影響EPS產(chǎn)量的曲面圖及其等高線圖Fig.3 Three-dimensional plot and corresponding contour plot of EPS vs.the initial pHand fermentation time

圖4 酵母粉和發(fā)酵時(shí)間交互影響EPS產(chǎn)量的曲面圖及其等高線圖Fig.4 Three-dimensional plot and corresponding contour plot of EPS vs.yeast extract and fermentation time

3 結(jié) 語

在諸多適合于乳酸菌生長的培養(yǎng)基中,確定Eliker培養(yǎng)基最適合乳酸乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖。由于乳酸菌代謝中減少乳酸形成,可能會(huì)使更多的碳原子脫離糖酵解反應(yīng)進(jìn)入EPS的合成,所以發(fā)酵過程p H值變化幅度小,有利于 EPS的積累。實(shí)驗(yàn)中還注意到EPS產(chǎn)量在達(dá)到最大時(shí),細(xì)菌的生物量也最大。

利用 Plackett-Burman設(shè)計(jì),評(píng)價(jià)了培養(yǎng)基各組分和主要工藝參數(shù)對(duì)胞外多糖合成的影響,成功篩選出關(guān)鍵因子。其中酵母粉作為菌株生長所需氮源影響最顯著[24],其次是發(fā)酵時(shí)間,EPS顯著降低可能與酶降解或培養(yǎng)基物理參數(shù)的改變有關(guān)[25],相對(duì)較小的是初始p H值,可能因?yàn)檎麄€(gè)發(fā)酵過程變化幅度比較緩和。

中心組合設(shè)計(jì)是響應(yīng)曲面分析法中用得最為廣泛的二階試驗(yàn)設(shè)計(jì),作者通過回歸方程的方差分析檢驗(yàn),確定關(guān)鍵因子對(duì)胞外多糖合成量影響的顯著性程度,從而確定出優(yōu)化的回歸方程:Y=3.699 355+0.578 7A-0.101 0B+0.155 1C-0.367 1A2-0.306 6B2-0.217 1C2。根據(jù)回歸方程的計(jì)算,求的最優(yōu)酵母粉質(zhì)量濃度17.35 g/L,初始p H 5.85,發(fā)酵時(shí)間23.18 h。利用最優(yōu)條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果顯示回歸模型的預(yù)測值與試驗(yàn)的實(shí)測值較為接近,進(jìn)一步證明回歸模型具有較好的擬合度。

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