于培星

(河南金丹乳酸科技有限公司,河南鄲城477150)

D-乳酸是重要的手性中間體與有機(jī)合成原料,是多種手性物質(zhì)的前體,廣泛應(yīng)用于制藥、化妝品和高效低毒農(nóng)藥及除草劑等領(lǐng)域的手性合成。D-乳酸市場(chǎng)前景廣闊,D-乳酸的工業(yè)生產(chǎn)主要采用微生物發(fā)酵法[1-3],目前國(guó)外僅有2～3家D-乳酸生產(chǎn)企業(yè),而我國(guó)目前尚未開(kāi)展D-乳酸制備方面的研究,也沒(méi)有工業(yè)化生產(chǎn)的企業(yè),因此研究開(kāi)發(fā)D-乳酸生產(chǎn)技術(shù),對(duì)于擴(kuò)大我國(guó)乳酸產(chǎn)品的種類和應(yīng)用領(lǐng)域具有十分重要的意義。微生物發(fā)酵法[4]利用可再生的淀粉質(zhì)資源為主要原料生產(chǎn)D-乳酸,具有生產(chǎn)成本低、產(chǎn)物光學(xué)純度高、生產(chǎn)條件溫和、污染小等優(yōu)點(diǎn),是目前生產(chǎn)D-乳酸的主要方法。國(guó)外的D-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)中采用的生產(chǎn)菌株有德氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌和左旋乳酸芽孢桿菌[5]等。作者選用了所產(chǎn)D-乳酸純度較高、糖酸轉(zhuǎn)化率高的凝結(jié)芽孢乳桿菌作為出發(fā)菌株,通過(guò)物理與化學(xué)復(fù)合誘變篩選出一株D-乳酸光學(xué)純度高、產(chǎn)酸率高的突變株,為D-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株 JD-063D,河南金丹乳酸科技有限公司技術(shù)中心分離選育和保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基:蛋白胨 10.0 g,肉浸膏10.0 g,酵母抽提物5.0 g,葡萄糖20.0 g,三水醋酸鈉晶體5.0 g,檸檬酸三銨2.0 g,K2HPO42.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,MnSO4·2H2O 0.05 g,Tween 801.0 mL,蒸餾水定容1 000 mL,調(diào)節(jié)p H值為7.0,高壓115℃滅菌15 min,固體培養(yǎng)基加入瓊脂15.0 g。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖40 g,蛋白胨20 g,酵母抽提物10 g,碳酸鈣10 g,分裝250 mL三角瓶,每瓶40 mL,8層紗布扎口,高壓115℃滅菌15 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖160 g,蛋白胨1.5 g,酵母粉15.0 g,檸檬酸三銨2.0 g,K2HPO42.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,MnSO4·2H2O 0.05 g,Tween 80 1.0 mL,蒸餾水1 000 mL,高壓115 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑 酵母抽提物、蛋白胨:英國(guó) OXOID公司產(chǎn)品;L-乳酸標(biāo)樣:Sigma公司產(chǎn)品;L-和D-乳酸試劑盒:山東省科學(xué)院提供;葡萄糖、K2HPO4等主要試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 5升發(fā)酵罐:上海保興生物設(shè)備工程有限公司產(chǎn)品;250B型恒溫培養(yǎng)箱:江蘇金壇大中儀器廠產(chǎn)品;752型紫外分光光度計(jì):鄭州市精科分析儀器有限公司產(chǎn)品;數(shù)碼生物顯微鏡:上海光學(xué)儀器廠產(chǎn)品;PHS—2C型酸度計(jì):上海偉業(yè)儀器廠產(chǎn)品、SBA-生物傳感分析儀:山東省科學(xué)院生物研究所產(chǎn)品;臺(tái)式離心機(jī):上海科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 紫外線(UV)誘變 出發(fā)菌株經(jīng)活化培養(yǎng)后,制備細(xì)胞菌懸液。取5 mL菌懸液放置于經(jīng)過(guò)滅菌的帶磁力棒的培養(yǎng)皿(直徑90 mm)中,培養(yǎng)皿放置在磁力攪拌器載物臺(tái)上,開(kāi)啟攪拌器,在的紫外燈下(距離為30 cm)邊照射邊攪拌,并計(jì)時(shí)。分別在 0.5、1.0、1.5、3.0、5.0 min 各取 2 mL 菌液混合,進(jìn)行倍數(shù)稀釋后,涂布于p H4.2的 YE平板,45℃,培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)[6-8]。

1.2.2 硫酸二乙酯(DES)誘變 向一定濃度的菌懸液中加入1%的DES,振蕩20～120 min后立即加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的Na2S2O3溶液終止反應(yīng),處理后的菌懸液稀釋至一定濃度涂布于p H 4.0的 YE平板,45℃,恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。計(jì)算DES不同處理時(shí)間的致死率和形態(tài)變異率,確定DES的最適處理時(shí)間。

1.2.3 鈷60誘變 取10 mL菌懸液于無(wú)菌試管中,分別以 15、10萬(wàn)倫琴進(jìn)行鈷 60γ-射線照射處理。

1.2.4 微波誘變 取10 mL菌懸液放入直徑15 cm的平皿中,調(diào)整微波功率為650 W,脈沖頻率為2 450 Hz,輻照處理 20、40、60 s,迅速取出作稀釋處理。

1.2.5 發(fā)酵試驗(yàn) 將JD-063D和復(fù)合誘變后突變菌株于50℃MRS靜止過(guò)夜培養(yǎng),再接種于MRS培養(yǎng)基中,50℃培養(yǎng)15 h,按體積分?jǐn)?shù)5%接種量于5 L發(fā)酵罐,3.5 L工作體積,轉(zhuǎn)速150 r/min,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的Ca(OH)2控制發(fā)酵液p H值。每隔兩小時(shí)取樣,測(cè)定菌體密度(A600)、乳酸濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.3 分析方法

1.3.1 生物量分析 細(xì)胞密度用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A600:將發(fā)酵液離心后收集菌體,生理鹽水洗滌兩次,然后重懸于生理鹽水中,調(diào)整細(xì)胞密度A600在10左右,取50 mL菌體溶液于稱量瓶中105℃干燥至恒重,稱重并計(jì)算。每單位菌體密度相當(dāng)于0.35 g/L菌體干重。

1.3.2 EDTA滴定法定量分析乳酸鈣 取發(fā)酵液2 mL,8 000 r/min,離心5 min,取上清液1 mL于100 mL的蒸餾水中,加入1.0 mol/L的NaOH 10 mL,加鈣指示劑2滴,用 0.05 mol/L EDTANa2試劑滴定,終點(diǎn)為溶液顏色變?yōu)榧兯{(lán)色。由滴定的EDTANa2體積計(jì)算乳酸鈣和乳酸的含量。計(jì)算公式如下:

其中:V為滴定消耗EDTANa2的量(mL);c為EDTANa2的濃度(mol/L)

1.3.3 乳酸分析 發(fā)酵液中乳酸用 HPLC方法檢測(cè)[9],實(shí)驗(yàn)儀器為美國(guó) Waters2575高效液相色分析儀,檢測(cè)條件如下:

色譜分離柱:SCR-101H柱;檢測(cè)器:1525紫外檢測(cè)器;流動(dòng)相:0.01 mol/L

磷酸鹽緩沖溶液(p H 2.5);流動(dòng)相流速:0.8 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5μL。

L-和D-乳酸采用手性色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定。

發(fā)酵液L-乳酸采用SBA-40C葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀分析[10]。

1.3.4 葡萄糖分析 采用費(fèi)林試劑法和SBA-40C葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株選育

出發(fā)菌株凝結(jié)芽孢JD-063D在固體平板培養(yǎng)上培養(yǎng)時(shí),形成微小圓形菌落,在CaCO3—MRS平板上培養(yǎng)48 h后,菌落呈白色,且在菌落周圍能形成明顯的透明圈和變色圈。將變色圈明顯和透明圈大的菌落轉(zhuǎn)入試管保存,并作為誘變的出發(fā)菌株。

2.1.1 出發(fā)菌株降糖曲線和產(chǎn)酸曲線 按照2.1所述方法,在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),JD-063D葡萄糖發(fā)酵結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出JD-063D乳酸發(fā)酵主要代謝葡萄糖產(chǎn)生乳酸,隨著發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度的逐步下降,乳酸質(zhì)量濃度逐漸增加,當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度下降到25 g/L以后,產(chǎn)酸基本停止,葡萄糖也不再被消耗,故確定最終發(fā)酵時(shí)間為92 h,此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)酸61 g/L,葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85.6%。

2.1.2 出發(fā)菌株JD-063D的生長(zhǎng)曲線 出發(fā)菌株JD-063D在種子培養(yǎng)基中,45℃靜止培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線如圖2所示。

圖2 出發(fā)菌株JD-063的生長(zhǎng)曲線Fig.2 G rowth curve of the starting strain JD-063D

由圖可知,JD-063D在培養(yǎng)8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體量呈現(xiàn)出指數(shù)增長(zhǎng),同時(shí)p H值開(kāi)始下降。在14～16 h左右對(duì)數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束,轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期,使A600保持1.2以上,故選取培養(yǎng)時(shí)間為12 h的細(xì)胞作為誘變用菌體。

2.2 D-乳酸生產(chǎn)菌的誘變路線

D-乳酸生產(chǎn)菌的誘變路線,見(jiàn)圖3。

圖3 D-乳酸生產(chǎn)菌的誘變路線圖Fig.3 Mutant roadmap of D-lactic acid production strain

2.3 D-乳酸生產(chǎn)菌株誘變選育結(jié)果與討論

以凝結(jié)芽孢桿菌JD-063D為出發(fā)菌株,經(jīng)紫外線、硫酸二乙酯、鈷60γ-射線、微波進(jìn)行交替誘變處理,其誘變結(jié)果如表1。

從表1可以看出,以凝結(jié)芽孢桿菌JD-063D為出發(fā)菌株,采用紫外線誘變時(shí)間為5～20 min,共挑選菌株59株,經(jīng)發(fā)酵篩選后獲得正突變株33株,其中ZLA-18產(chǎn)酸較高,產(chǎn)酸87 g/L,較出發(fā)菌株(61 g/L)提高42.6%,產(chǎn)酸提高幅度較大,效果非常明顯。又以ZLA-18為出發(fā)菌株,用硫酸二乙酯進(jìn)行不同時(shí)間的誘變處理,共挑選菌落51株,經(jīng)發(fā)酵試驗(yàn)初篩獲得正突變株17株,其中 ZLB-47產(chǎn)酸較高,產(chǎn)酸率達(dá)到110 g/L,較出發(fā)菌株提高26.4%,以ZLB-47為出發(fā)菌株進(jìn)行鈷60γ-射線輻照處理,根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇劑量為15萬(wàn)、10萬(wàn)倫琴,共挑選菌落38株,初篩后獲得正突變株 17株,其中 ZLC-26、ZLC-28產(chǎn)酸較高,產(chǎn)酸率分別達(dá)到128、123 g/L,較出發(fā)菌株分別提高11.63%和11.18%,經(jīng)重復(fù)試驗(yàn),ZLC-26重現(xiàn)性較ZLC-28好。產(chǎn)酸提高幅度不大的原因可能是菌株敏感度降低或鈷60γ-射線處理劑量不夠造成;然后以ZLC-26為出發(fā)菌株,選擇了微波誘變,分別處理20、40、60 s,挑選菌株57株正突變27株,ZLD-58產(chǎn)酸較高,產(chǎn)酸率達(dá)到145 g/L,產(chǎn)酸率較出發(fā)菌株 ZLC-26提高13.28%,較原出發(fā)菌株JD-063D提高137.7%,取得良好效果,將突變菌株ZLD-58命名為JD-76D。

表1 D-乳酸生產(chǎn)菌株誘變選育結(jié)果Tab.1 The mutation results of D-lactic acid production strain

2.4 突變菌株的發(fā)酵性能試驗(yàn)

將復(fù)合誘變得到的突變菌株JD-76D與出發(fā)菌株JD-063D分別在含15%CaCO3的發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中發(fā)酵48 h,觀察其乳酸發(fā)酵情況。結(jié)果如圖4所示,復(fù)合誘變的突變菌株JD-76D產(chǎn)酸率提高顯著,產(chǎn)酸速率提高了59%。,而多次復(fù)合誘變得到的菌株JD-76D的產(chǎn)酸速率在1.50 g/(L·h)左右,比出發(fā)菌株提高0.3 g/(L·h)。

圖4 復(fù)合誘變后菌株JD-76D的耗糖與產(chǎn)酸曲線Fig.4 The curves between glucose and lactic acid of JD-76D after multiple mutation

2.5 突變菌株的穩(wěn)定性試驗(yàn)

為了確保篩選到的高產(chǎn)菌JD-76D的遺傳穩(wěn)定性,對(duì)其做了遺傳穩(wěn)定性考察。每代實(shí)驗(yàn)過(guò)程:高產(chǎn)菌株自然分離→單菌落→斜面→種瓶→搖瓶發(fā)酵,測(cè)L-乳酸產(chǎn)量等指標(biāo)。共傳10代,每代均做3個(gè)平行樣。突變菌株JD-76D產(chǎn)酸基本維持在145 g/L左右,產(chǎn)酸速率維持在1.50 g/(L·h)左右,D-乳酸純度98.5%以上,其發(fā)酵產(chǎn)品液相色譜圖見(jiàn)圖5,說(shuō)明菌株JD-76D遺傳穩(wěn)定性較好。

圖5 菌株ZLD-58發(fā)酵產(chǎn)品液相色譜檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The testing results of the fermentation product of Strain ZLD-58 using liquid chromatography

3 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)對(duì)出發(fā)菌株JD-063D進(jìn)行物理化學(xué)復(fù)合誘變,篩選得到了一株高產(chǎn)菌株JD-76D,產(chǎn)酸由出發(fā)菌株的61 g/L提高到145 g/L、D-乳酸純度由原菌株的97.5%增加到98.7%以上,該菌株通過(guò)工藝優(yōu)化有著較高的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

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