王立東, 阮長青, 郎雙靜

(1.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶163319;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶 163319)

氧化樂果是目前中國常用的大噸位農(nóng)藥品種之一,雖然該農(nóng)藥的使用為保證農(nóng)作物的豐收起到了重要的作用,但其高毒、對農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境存在較嚴(yán)重的污染等問題,越來越引起人們的重視[1]。微生物降解是消除有機磷農(nóng)藥污染最主要的途徑,國外從20世紀(jì)50年代開始研究有機磷農(nóng)藥的治理技術(shù),確認(rèn)微生物降解有機磷農(nóng)藥具有費用省、環(huán)境影響少、可最大限度降低污染物濃度、可用于其他技術(shù)難以應(yīng)用的場地等優(yōu)點[2-3]。Wackett等[4]從土壤中分離出一株假單胞菌能降解除草劑阿特拉津,能以阿特拉津為惟一氮源,在90 min內(nèi)使100 mg/L阿特拉津完全降解。楊惠芳等5]研究發(fā)現(xiàn),添加降解菌可促進土壤中殺蟲劑單甲咪的降解。由此可見,用微生物控制農(nóng)藥污染的生物修復(fù)技術(shù)顯示出廣闊的應(yīng)用前景,但是由于農(nóng)藥污染環(huán)境的化合物組成很不穩(wěn)定,環(huán)境中溫度、p H值及通氣量等波動也較大,有可能抑制特定優(yōu)勢微生物的生長。另外,投放到環(huán)境中去的特定微生物種群還會受到該環(huán)境土著微生物種群的影響,甚至受到拮抗而不能在該環(huán)境中成為優(yōu)勢種群[6-8]。

作者通過對實驗室篩選出的菌株L-3對氧化樂果降解培養(yǎng)基及環(huán)境條件的優(yōu)化,希望探尋更有利于菌體生長的條件,從而提高對氧化樂果的降解效果,為氧化樂果降解試驗的進一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

GC-9900氣相色譜儀:上?？苿?chuàng)色譜儀器有限公司制造;NDP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱、TGL-16B臺式離心機、722S型分光光度計:上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);LRH-280型微電腦控制生化培養(yǎng)箱:廣東省醫(yī)療器械廠制造;SG2型p H計:梅特勒-托利多儀器上海有限公司生產(chǎn)。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

普通培養(yǎng)基:牛肉膏 3.0 g,蛋白胨 10.0 g,NaCl 5.0 g,蒸餾水 1 000 mL,p H 7.0。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:NaCl 0.5 g,KH2PO40.5 g,K2HPO41.5 g,MgSO40.5 g,蒸餾水1 000 mL,p H 7.0。

分離培養(yǎng)基A:NH4NO30.5 g,Na2HPO41.19 g,KH2PO40.45 g,MgSO40.45 g,瓊脂 15 g,蒸餾水1 000 mL,p H 7.0,使用前加入500 mg/L氧化樂果溶液。

分離培養(yǎng)基B:NaNO32 g,KCl 0.5 g,MgSO40.5 g,MnSO40.10 g,BaCl20.05 g,CaCl20.05 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL,p H 7.0,使用前加入500 mg/L氧化樂果溶液。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖17 g,牛肉蛋白胨9.2 g,KH2PO41.84 g,KCl 1.0 g,MgSO40.50 g,MnSO40.10 g,BaCl20.05 g,CaCl20.05 g,蒸餾水 1 000 mL,p H 7.0,氧化樂果500 mg/L。

菌種:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院實驗室分離制得,鑒定為假單胞菌,命名為L-3。

農(nóng)藥試劑:40%氧化樂果乳油,北京金宏大生化有限公司產(chǎn)品。

1.3 菌株活化的方法

接種菌株于普通培養(yǎng)基中,30℃下于160 r/min振蕩培養(yǎng) 12～18 h,備用[8]。

1.4 氣相色譜的檢測條件、方法及降解率的計算方法

1.4.1 檢測條件 GC-9900氣相色譜儀。條件:不銹鋼柱SE-30(4 mm×1 m)。柱溫180℃、氣化室225℃、檢測器溫度220℃;氮氣流量50 mL/min,氫氣流量60 mL/min,空氣流量46 mL/min;檢測器為FPD。

1.4.2 檢測方法 采用國標(biāo)GB/T 14552-2003的方法進行測定。

1.4.3 降解率計算

1.5 試驗方法

1.5.1 碳源的選擇及其質(zhì)量濃度對氧化樂果降解的影響 在含500 mg/L氧化樂果的分離培養(yǎng)基A中分別加入0.5 g/dL的不同碳源,并將制備好的菌懸液以3%的接種體積分?jǐn)?shù)接入到培養(yǎng)液中,在p H 7.0、30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)3 d,用氣相色譜法測定降解前后氧化樂果的質(zhì)量濃度,計算降解率,同時測定OD600值。

將優(yōu)選出最適碳源以不同質(zhì)量濃度添加到含500 mg/L氧化樂果的分離培養(yǎng)基A中,測定不同底物質(zhì)量濃度條件下氧化樂果的降解率,選出最適碳源質(zhì)量濃度。

1.5.2 氮源的選擇及質(zhì)量濃度對氧化樂果降解的影響 以相同質(zhì)量濃度的其它氮源代替含500 mg/L氧化樂果的分離培養(yǎng)基B中的NaNO3,并將制備好的菌懸液以3%的接種體積分?jǐn)?shù)接入到培養(yǎng)液中 ,在 p H 7.0、30 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng) 3 d,用氣相色譜法測定降解前后氧化樂果的體積分?jǐn)?shù),計算降解率,同時測定OD600值。

將優(yōu)選出最適氮源以不同質(zhì)量濃度添加到含500 mg/L氧化樂果的分離培養(yǎng)基B中,測定不同氮源質(zhì)量濃度條件下氧化樂果的降解率,選出最適氮源質(zhì)量濃度。

1.5.3 磷源的選擇及質(zhì)量濃度對氧化樂果降解的影響 在含500 mg/L氧化樂果的分離培養(yǎng)基A和分離培養(yǎng)基B中加入一定的蔗糖,接種培養(yǎng)3 d后,測定不同培養(yǎng)基中氧化樂果的降解率,并過對培養(yǎng)基中成分進行分析。

將優(yōu)選出磷源以不同質(zhì)量濃度添加到含500 mg/L氧化樂果的分離培養(yǎng)基B中,測定不同磷源質(zhì)量濃度條件下氧化樂果的降解率,選出最適磷源質(zhì)量濃度。

1.5.4 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)實驗確定降解培養(yǎng)基降解培養(yǎng)基中C、N、P最佳質(zhì)量濃度的確定采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計,實驗因子的水平及編碼見表1[9]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:采用DPS軟件(3.01專業(yè)版)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

表1 實驗因素與水平Tab.1 Test facts and levels

1.5.5 不同環(huán)境條件對降解的影響

1)不同p H值對降解效率的影響:制備菌懸液,以3%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于優(yōu)化的降解培養(yǎng)液中,調(diào)p H 值依次為 5、6、7、8、9、10,添加 500 mg/L氧化樂果,設(shè)不接菌的空白為對照,每處理重復(fù)3次,測定降解率。

2)不同溫度對降解效率的影響:制備菌懸液,以3%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于含500 mg/L氧化樂果的100 mL優(yōu)化的降解培養(yǎng)液(p H 7.0)中,同時設(shè)不接菌的空白對照 ,分別于 15、20、25、30、35、40℃控溫?fù)u床培養(yǎng)72 h,搖床轉(zhuǎn)速160 r/min,每處理重復(fù)3次,測定降解率。

3)不同接種接體積分?jǐn)?shù)對降解效率的影響:制備菌懸液,分別以 1%、2%、3%、4%、5%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于含500 mg/L氧化樂果的100 mL優(yōu)化的降解培養(yǎng)液(p H 7)中,30 ℃、160 r/min,搖床培養(yǎng)72 h,設(shè)不接菌的空白對照,每處理重復(fù)3次,測定降解率。

4)不同初始氧化樂果的質(zhì)量濃度對菌株L-3降解效率的影響:制備菌懸液,分別接種于含50、100、200、400、800 mg/L 氧化樂果的 100 mL 優(yōu)化的降解培養(yǎng)液中,30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng),每隔24 h測定氧化樂果的降解率,繪制生長曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對L-3菌落降解氧化樂果能力的影響

不同碳源對氧化樂果降解效率的影響見圖1。由圖1可以看出,添加的碳源中,蔗糖的降解率最高,降解率高達72.03%,添加葡萄糖、果糖、乳糖的培養(yǎng)液也能夠降解氧化樂果,但稍低于蔗糖,添加可溶性淀粉的培養(yǎng)液對氧化樂果的降解率很低,所以選擇蔗糖作為培養(yǎng)液的碳源;培養(yǎng)基中菌體的生長狀況與對氧化樂果降解情況一致,即在碳源為蔗糖時菌體的生長量也達到最大。

圖1 碳源對氧化樂果降解的影響Fig.1 Influence of different carbon source during degradation

2.2 蔗糖質(zhì)量濃度對L-3菌降解氧化樂果的影響

不同的蔗糖質(zhì)量濃度對氧化樂果降解效果的影響見圖2。

圖2 不同蔗糖質(zhì)量濃度對氧化樂果降解的影響Fig.2 Effect of sucrose concentration on degradation rate

從圖2可以看出,在氧化樂果質(zhì)量濃度一定的條件下,無蔗糖的存在,菌株不能降解氧化樂果,隨著蔗糖質(zhì)量濃度的升高,菌株對氧化樂果的降解率明顯提高,菌株含量在1%～1.5%的范圍時,氧化樂果的降解率最高,隨著蔗糖質(zhì)量濃度進一步升高,降解率反而下降。

2.3 不同氮源對L-3菌落降解氧化樂果能力的影響

不同的氮源對氧化樂果降解效率的影響見圖3。從圖3可以看出,有機氮比其它無機氮有利于菌體的生長,降解效果好。在有機氮中,牛肉蛋白胨的降解效果高于胰蛋白胨和酵母浸粉,為最適的氮源;培養(yǎng)基中菌體的生長狀況與對氧化樂果的降解情況一致,即在氮源為牛肉蛋白胨時菌體的生長量達到最大。

圖3 不同氮源對氧化樂果降解率的影響Fig.3 Influence of different nitrogen source during degradation

2.4 牛肉蛋白胨質(zhì)量濃度對L-3菌降解氧化樂果的影響

不同的牛肉蛋白胨質(zhì)量濃度對氧化樂果降解效果的影響見圖4。

圖4 不同牛肉蛋白胨質(zhì)量濃度對氧化樂果降解率的影響Fig.4 Effect of different beef peptone concentration on degradation rate

從圖4可以看出,在未添加外加氮源時,菌株能夠降解氧化樂果,說明菌株能以氧化樂果為惟一氮源生長。當(dāng)牛肉蛋白胨的質(zhì)量濃度為0.5 g/dL時,降解效果最好,降解率高達76.32%,隨著牛肉蛋白胨質(zhì)量濃度的增加,降解率有所下降。

2.5 KH2PO4質(zhì)量濃度對L-3菌降解氧化樂果的影響

不同磷源培養(yǎng)基中氧化樂果的降解率見表2。通過表2可以看出,接種3 d后的分離培養(yǎng)基A中的氧化樂果的降解率為74.34%,分離培養(yǎng)基B中的降解率為45.67%,分離培養(yǎng)基A比分離培養(yǎng)基B高出相差28.67%。同時分離培養(yǎng)基B中不含磷元素,說明菌株能夠以氧化樂果為惟一磷源,磷鉬藍分光光度法檢測發(fā)酵液無磷酸生成。

表2 不同磷源培養(yǎng)基中氧化樂果的降解率Tab.2 Degradation rate of different phosphorus source medium

KH2PO4質(zhì)量濃度對氧化樂果降解率的影響見圖5。由圖5可以看出,加入一定量的 KH2PO4對降解有促進作用,當(dāng) KH2PO4的質(zhì)量濃度為0.1 g/dL時,降解效果最好,降解率高達78.58%,隨著KH2PO4質(zhì)量濃度的增大,降解率有所下降。

圖5 KH2PO4質(zhì)量濃度對氧化樂果降解率的影響Fig.5 Effect of KH2PO4concentration on degradation rate

2.6 二次正交實驗結(jié)果與分析

通過以上的單因素實驗研究了培養(yǎng)基的C,N,P組分對降解的影響,最佳C,N,P質(zhì)量濃度為:蔗糖1.50 g/dL,牛肉蛋白胨 0.5 g/dL,KH2P040.1 g/dL。根據(jù)單因素最佳C,N,P含量確定因素的上下限,從而進一步通過二次正交實驗確定降解培養(yǎng)基的組成。各處理的降解率的測定結(jié)果見表3。

2.6.1 回歸方程的建立 為考察各因素對氧化樂果降解的影響,根據(jù)表3中試驗結(jié)果,以降解率為指標(biāo),對實驗結(jié)果進行分析,見表4,可得出三因素與降解率之間的回歸方程為:

表3 培養(yǎng)基中C、N、P含量對降解率的影響Tab.3 Effect of carbon、nitrogen and phosphorsources ondegradation rate

表4 回歸旋轉(zhuǎn)正交組合計算結(jié)果Tab.4 Calculating results of two revolving orthogonal experiment

2.6.2 回歸方程的顯著性檢驗 為了檢驗回歸方程的顯著性,計算各類偏差平方和,結(jié)果見表5。

表5 回歸旋轉(zhuǎn)正交組合方差分析Tab.5 Error analysis of two revolving orthogonal experiment

首先,用F1來檢驗回歸方程擬合情況,由表5可知,F1=3.60F0.05(9,13)=2.72,方程在α=0.05水平上顯著,說明在各個處理水平的結(jié)果之間存在差異,二次回歸方程與實際情況擬合的較好,可以作為實驗操作的數(shù)學(xué)模型,即可以通過計算降解率來表示氧化樂果的降解情況。

2.6.3 回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗 由于是正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計,可用各偏回歸平方和Q進行F檢驗或t檢驗,實驗中選擇t檢驗剔除回歸方程的不顯著項。經(jīng)t檢驗可知,回歸方程中t1、t3不顯著,被剔除,其他回歸系數(shù)均在不同程度上顯著,因此回歸方程可寫為:

2.6.4 回歸方程的優(yōu)化分析 方程局部最優(yōu)點是最佳的實驗水平,利用求偏導(dǎo)數(shù)的方法求解最優(yōu)水平,對回歸方程求一階偏導(dǎo),并當(dāng)?shù)竭_局部最優(yōu)點時,導(dǎo)數(shù)為零,此計算點為駐點,可能為回歸方程的極值,再計算回歸方程在其定義域內(nèi)各端點的函數(shù)值進行比較,則其中的最大值為回歸方程的最優(yōu)值。求偏導(dǎo)解方程組得到:x1=0.717,x2=0.812,x3=0.718,計算駐點f(0.717,0.812,0.718)及回歸方程在其定義域內(nèi)各端點值發(fā)現(xiàn),其中端點f(1.682,-1.682,1.682)為最大值,將編碼值換算成實際值時,按Zj=Z0j+xjΔj進行計算,確定優(yōu)化條件。

即當(dāng)蔗糖為1.7 g/dL,牛肉蛋白胨為0.92 g/dL,KH2PO4為0.184 g/dL,菌株降解氧化樂果的能力最強,此時培養(yǎng)基組成為優(yōu)化的降解培養(yǎng)基組成。

最適培養(yǎng)基降解效果驗證試驗:在優(yōu)化培養(yǎng)基中,菌種培養(yǎng)3 d氧化樂果的降解率為82.59%,測定結(jié)果均高于三元二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計實施的23次實驗。

2.6.5 各因素重要性分析 對于由實驗數(shù)據(jù)所建立的二次回歸方程,可利用對二次方程系數(shù)的檢驗結(jié)果,來判斷因素對氧化樂果降解率的影響,即求出方程各因素對指標(biāo)的貢獻率大小。

利用貢獻率判斷因素主次,對二次方程按如下公式求得回歸系數(shù)方差比F(j)、F(jj)、F(ij)。

由以上計算可知:Δ1>Δ2>Δ3,所以對于氧化樂果降解的過程中,得到各個不同因素的影響效果順序為:碳源>氮源>磷源。

2.7 不同環(huán)境條件對氧化樂果降解的影響

2.7.1 p H值對降解效率的影響 不同p H條件下菌株L-3對氧化樂果的降解效果見圖6。

圖6 L-3在不同pH值條件下對氧化樂果的降解效果Fig.6 Degradations of omethoate by isolate L-3 under different culture pH

由圖6可以看出,在p H 5～10范圍內(nèi),氧化樂果都能降解,以p H 7效果最好。在較強的堿性條件下(p H 9～10),氧化樂果有一部分自然降解,可知氧化樂果在弱酸和中性的條件下生長穩(wěn)定。

2.7.2 溫度對降解效率的影響 不同溫度條件下菌株L-3對氧化樂果的降解效果見圖7。

圖7 培養(yǎng)溫度對菌株降解效果的影響Fig.7 Degradations of omethoate by isolate L-3 under different culture temperature

由圖7可以看出,在15～25 ℃范圍內(nèi),氧化樂果的降解率偏低,說明低溫條件不利于氧化樂果的降解;在25～40℃范圍內(nèi),氧化樂果的降解效果較好,30℃時降解率最高。L-3菌株降解氧化樂果的最適溫度與其最適生長溫度是一致的。在較高的溫度條件下35～40℃氧化樂果有一部分自然降解。

2.7.3 不同接菌種體積分?jǐn)?shù)對降解效率的影響不同接菌體積分?jǐn)?shù)條件下菌株L-3對氧化樂果的降解效果見圖8。

圖8 接種體積分?jǐn)?shù)對氧化樂果降解效果的影響Fig.8 Degradation of omethoate by isolate L-3 with different inocula quantities

由圖8可以得出,隨著接種體積分?jǐn)?shù)的增加,菌株L-3對氧化樂果的降解率呈先升后降的趨勢,當(dāng)菌體接種體積分?jǐn)?shù)為3%時,氧化樂果的降解率最高,達80.16%。

2.7.4 菌株L-3對不同初始質(zhì)量濃度氧化樂果的降解 菌株L-3對不同初始氧化樂果濃度的降解效果見圖9。

圖9 不同初始質(zhì)量濃度氧化樂果對降解率的影響Fig.9 Effect of different omethoate concentration on degradation rate

從圖9可以看出,經(jīng)過5 d的培養(yǎng),降解率為72.58%～77.71%。50 mg/L的氧化樂果降解速度相對較快,3 d后降解基本穩(wěn)定,最終降解率為72.58%;其它幾種質(zhì)量濃度氧化樂果的降解趨勢基本相似,5 d后降解趨于穩(wěn)定。

3 結(jié) 語

作者對從農(nóng)藥生產(chǎn)廠污泥中篩選出能夠高效降解氧化樂果的假單胞菌L-3的降解條件進行優(yōu)化,并對環(huán)境條件對氧化樂果降解效果的的影響進行了研究,得出菌株L-3最適的降解條件:碳源為蔗糖、氮源為牛肉蛋白胨、磷源為 KH2PO4;二次正交回歸設(shè)計得出最佳的降解條件為蔗糖質(zhì)量濃度為1.7 g/dL、牛肉蛋白胨質(zhì)量濃度為0.92 g/dL、KH2PO4質(zhì)量濃度為0.184 g/dL,在優(yōu)化的培養(yǎng)基中對氧化樂果進行降解,其降解率高達82.59%;最適的環(huán)境條件為p H 7～8,溫度30℃,接種體積分?jǐn)?shù)3%,初始氧化樂果質(zhì)量濃度為50 mg/L;優(yōu)化后氧化樂果的降解率高達82.59%。

[1]仲維科,郝戩,孫梅心,等.我國食品的農(nóng)藥污染問題[J].農(nóng)藥,2000,39(7):1-3.ZHONG Wei-ke,HAO Ji,SUN Min-xin,et al.Pestides residues in food in China[J].Pesticides,2000,39(7):1-3.(in Chinese)

[2]Donna Chaw,Ulrica Stoklas.Composting of cattle manure and hydrocarbon contaminated flare pit soil[J].Compost Science and Utilization,2001,9(4):322-335.

[3]Harruta S,Cui Z,Huang Z.Construction of a stable microbial community with high cellulose-degradation ability[J].Applied Microbiol Biotechnology,2002,59:529-534.

[4]Wackett,Prenafeta-Bold F X,Opsteeg J L,et al.Biodegradation of azo hyes in coculture of anaerobic granular sludge with aerobic aromatic amine degrading enrichment culture[J].Appl Microbil Biotechnol,1999,51:865-871.

[5]王保軍,劉志培,楊慧芳.甲單咪農(nóng)藥的微生物降解代謝研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報,1998,18(3):298-302.WANGBao-jun,LIU Zhi-pei,YANG Hui-fang.Microbiological deterioration metabolism of jdm pesticide[J].Environmental Science Journal,1998,18(3):298-302.(in Chinese)

[6]Kauatner M,Mahro B.Microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soils affected by the orgnic matix of compost[J].Appl Microbil Biotechnol,1996,44:668-675.

[7]Filippi C,Bedini S,Levi-Minzi R,et al.Cocomposting of olive oil mill by-productis:chemcial and mocrodiological evaluations[J].Compost Science and Utilization,2002,10(1):63-71.

[8]Fang M,Wong M H,Wong J W C.Digestion activity of thermophilic bacterial isolated from ash-amended sewage sludge compost[J].Water,Air and Soil Pollution,2001,126:8-12.