李邦印 孫衛(wèi)國 程小星 孫昌文 熊志紅 王仲元 王金河 蘇銳

(解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究室 北京 100091)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(M ycobacterium tuberculosis)所致的以呼吸道為主的慢性傳染病,是目前危害全球人類健康的主要傳染病之一。全世界每年約有(800～1 000)萬新發(fā)結(jié)核病例。結(jié)核病疫情有日益嚴(yán)重的趨勢(shì),難于防治,主要原因之一是由于對(duì)結(jié)核病早期診斷和預(yù)防的不足。獲得攜有足夠信息的結(jié)核分枝桿菌抗原,深入研究結(jié)核菌基因的功能,從分子生物學(xué)角度重新認(rèn)識(shí)結(jié)核分枝桿菌凸顯其關(guān)鍵性,并持續(xù)發(fā)掘其免疫診斷工具,變得越來越重要。差減雜交等實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) Rv2653c(類似于phiRv2)與phiRv1在部分弱毒和無毒分枝桿菌中是缺失的,且鮮有文獻(xiàn)對(duì)此進(jìn)行專門研究[1]。2008年,我們合成了 Rv2653c引物,以 H37Rv基因組DNA為模板,用PCR方法擴(kuò)增獲得了Rv2653c基因,嘗試在p ET24b載體進(jìn)行了高效表達(dá)研究。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究結(jié)核菌的遺傳學(xué)特征和篩選新抗原奠定了基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒來源 菌株:結(jié)核分枝桿菌 H37Rv株來源于生物制品檢定所;E.coli DH5α、E.coli BL 21(DE3),本室保存。質(zhì)粒:表達(dá)質(zhì)粒載體p ET-24b(Novagen)。臨床抗血清:5例結(jié)核病患者血清,結(jié)明實(shí)驗(yàn)3項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均為強(qiáng)陽性結(jié)果,明確診斷為肺結(jié)核。

1.2 主要試劑 EcoRⅠ,HindⅢ,T4 DNA Lig

ase(New England Biolabs);瓊脂糖、p GEM-T vector System-Ⅰ、IPTG、X-Gal、4 ×dN TP(Promega);Plantinum Taq DNA polymerase(Invitrogen);DNA快速純化試劑(賽百盛公司);蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Sigma);Chelating Sepharose Fast Flow蛋白純化試劑(Amersham Pharmacia);Western blo ting lum ino reagent(Santa cruz);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人 IgG(北京中山生物制品公司);引物合成和測(cè)序服務(wù)(上海生物工程公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)結(jié)核分枝桿菌基因組序列,針對(duì)RV 2653c基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物,采用 PCR擴(kuò)增的方法,以 H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板,擴(kuò)增目的基因。直接將基因插入克隆載體p GEM-T。正義鏈引物 :5′accggaattcttgacccacaagcgcactaaac;反義鏈引物 :5′gcccaagcttctgtttgctgtcgggttcgtc;兩端分別采用EcoR I和 Hind III限制性酶切位點(diǎn)。

1.3.2 PCR擴(kuò)增Rv2653c基因 PCR反應(yīng)程序:95℃×5min;94℃×20 s,60℃×20 s,72℃×90 s,32循環(huán);72℃延伸7min。

1.3.3 瓊脂糖電泳回收DNA片段 1.5%瓊脂糖電泳結(jié)束后,用干凈的手術(shù)刀片切下約0.5 kb DNA條帶,放入無菌的eppendrof管中,操作方法參照DNA回收試劑盒說明。

1.3.4 基因克隆與測(cè)序 PCR產(chǎn)物與p GEM-T連接,參照p GEM-T vecto r System-Ⅰ產(chǎn)品說明,克隆載體的鑒定初步采用藍(lán)白斑篩選,然后以PCR和限制性內(nèi)切酶酶切的方法鑒定白斑菌落。重組子樣品質(zhì)粒送往測(cè)序公司。

1.3.5 構(gòu)建表達(dá)載體p ET24b-Rv2與鑒定 EcoRⅠ和 HindⅢ限制性內(nèi)切酶從p GEM-Rv2切下約0.5 kb大小的基因片段與經(jīng)過同樣雙酶切的p ET24b的進(jìn)行快速連接,然后轉(zhuǎn)化DH5α,克隆篩選與鑒定具體方法均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。將p ET24b-Rv2重組質(zhì)粒重新測(cè)序。

1.3.6 重組蛋白的表達(dá)及其產(chǎn)物鑒定 (1)誘導(dǎo)表達(dá):分別將p ET24b-Rv2陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BL21(DE3),挑單克隆轉(zhuǎn)種于5m l含50μg/m l卡那霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃恒溫振蕩器培養(yǎng)過夜,然后以0.5%的比例轉(zhuǎn)接到200 m l含50μg/m l卡那霉素的LB培養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)至OD600值約0.8～1.0時(shí),加入 IPTG至終濃度為0.1 mmol/L,誘導(dǎo) 4～5 h。取出 ,冰浴 30min,離心 4 000 rpm ×10min,收集菌體,用 SDS-PAGE電泳方法鑒定表達(dá)產(chǎn)物。(2)純化重組蛋白末端攜6個(gè)組氨酸,可通過形成配位鍵而與金屬螯合親和層析柱上固定化的某些二價(jià)金屬離子(如鎳)結(jié)合。試劑及純化方法參照純化試劑盒的操作按說明書進(jìn)行。收集純化蛋白,用PEG濃縮后再透析,采用Low ry法定量蛋白濃度。1.3.7 重組蛋白抗原性分析 取純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)PVDF膜,然后以5例臨床結(jié)核患者血清多抗進(jìn)行Western blot,采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人 IgG作為二抗,初步分析rRv2653c的特異性。Western blot實(shí)驗(yàn)操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》和化學(xué)發(fā)光試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 釣取 Rv2653c基因 以 H37Rv基因組DNA為模板,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增獲得了大小約為0.5 kb的DNA片段。

2.2 Rv2653c的克隆與鑒定

2.2.1 克隆與 PCR擴(kuò)增鑒定 由結(jié)核菌基因組DNA擴(kuò)增來的PCR片段經(jīng)純化后直接與p GEM-T連接、轉(zhuǎn)化,挑選單克隆菌落快速提取質(zhì)粒,以此為模板,采用Rv2653c上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;鑒定結(jié)果見圖1。陽性重組子命名為p GEM-Rv2。

2.2.2 酶切鑒定 取重組質(zhì)粒5μl,用 EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切2 h;1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,重組質(zhì)粒可以切下約0.5 kb的片段見圖1。

2.2.3 序列測(cè)定 陽性重組子經(jīng)測(cè)定序列如下:與報(bào)道的序列一致。

圖1 p GEM-Rv2重組子鑒定

圖2 圖2 p ET24B-Rv2重組子鑒定

2.3 構(gòu)建重組表達(dá)載體及其重組蛋白的表達(dá)和純化

2.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 采用 EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切方法鑒定重組子(圖2)。發(fā)現(xiàn)均可以得到大小約為0.5 kb的DNA片段,重組子命名為p ET24b-Rv2,重新測(cè)定序列,見圖3。序列符合預(yù)期。

2.3.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 p ET24b-Rv2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL 21(DE3),用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá),收集菌體,用 SDS-PA GE電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)重組蛋白產(chǎn)量約占菌體總蛋白的20%左右。采用Chelating Sepharose Fast Flow純化融合蛋白,最后得到的重組蛋白產(chǎn)品純度可以達(dá)到90%以上(圖4)。

圖3 p ET24b-Rv2重組子基因序列

圖4 p ET24b-Rv2重組蛋白的表達(dá)與純化電泳鑒定圖譜

2.3.3 重組蛋白抗原性分析 對(duì)純化的融合蛋白進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示:重組蛋白與與結(jié)核患者血清有較強(qiáng)的反應(yīng)性,有抗原性。

圖5 重組蛋白的western blot分析

3 討論

結(jié)核分枝桿菌基因組的遺傳學(xué)演化史就是微生物適應(yīng)微環(huán)境,與時(shí)俱進(jìn)的歷史,結(jié)核菌不斷演化、進(jìn)化,以適應(yīng)外環(huán)境和人們對(duì)結(jié)核病的處置方式。部分結(jié)核菌菌株測(cè)序工作完成后,人們發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌基因組中有很多外來基因,這些基因可能在結(jié)核菌的不同生活時(shí)期扮演著不同的角色。

Rv2653c是我們?cè)趶?qiáng)毒菌株與弱毒株間進(jìn)行差減雜交分析得到的1個(gè)基因,基因組大小約10 kb,編碼107個(gè)氨基酸,其富含脯氨酸,與前噬菌體蛋白phiRv1和phiRv2序列有類似性,其蛋白結(jié)構(gòu)與其他細(xì)菌中噬菌體包裝相關(guān)蛋白類似[2-5],它們?cè)谥虏⌒越Y(jié)核菌如M TB、牛型分枝桿菌等中存在,而在非致病的卡介苗等弱毒株的基因組中丟失,有一定的遺傳學(xué)研究?jī)r(jià)值,相關(guān)文獻(xiàn)很少。它們?cè)谥虏【谐霈F(xiàn)而在非(弱)致病菌中缺失的表現(xiàn)非同尋常,值得我們進(jìn)一步去探索它在結(jié)核菌中的功能。目前該蛋白市場(chǎng)上有商品化的國外重組產(chǎn)品,而國內(nèi)沒有相關(guān)的研究。

本研究在大腸埃希菌中高效表達(dá)Rv2653c基因,獲得了高效表達(dá)的工程菌株,得到純度達(dá)到90%以上的重組蛋白。Western blot分析發(fā)現(xiàn),重組蛋白與結(jié)核病患者血清反應(yīng)強(qiáng)烈,這充分說明該重組蛋白的抗原性很好。拋開其遺傳學(xué)的角色概念,該蛋白可能還是一種潛在的診斷用抗原,該蛋白的免疫原性為其血清學(xué)檢測(cè)指示了另外的研究方向。

未來,我們將一方面利用現(xiàn)有的重組蛋白做一些有關(guān)其遺傳學(xué)角色的工作,闡述其在結(jié)核菌中的功能;另一方面,我們將進(jìn)行血清學(xué)特異性分析,并嘗試作為若干抗原成分之一,開展Elispot等方面的實(shí)驗(yàn),探討其是否可作為一種候選的診斷用抗原。

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