程立坤，徐慶陽(yáng)，謝希賢，陳 寧

(工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

HPLC快速測(cè)定發(fā)酵液中L–色氨酸

程立坤，徐慶陽(yáng)，謝希賢，陳 寧

(工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

建立一種測(cè)定發(fā)酵液中 L–色氨酸的高效液相色譜(HPLC)方法.以Agilent C18(5 μm，150.mm×4.6.mm)為分離柱，V(0.03%的KH2PO4溶液)∶V(甲醇)＝90∶10為流動(dòng)相，流量為1 mL/min，在278.nm處檢測(cè)L–色氨酸.該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，在 0.000～1.000.g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2＝0.999 9)，平均回收率為 98.93%，精密度(RSD)為0.247%，可有效應(yīng)用于發(fā)酵液中L–色氨酸含量的測(cè)定.

L–色氨酸；HPLC；檢測(cè)

L–色氨酸(L-tryptophan)對(duì)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育及新陳代謝起重要的作用，被稱為第二必需氨基酸，廣泛用于醫(yī)藥、食品和飼料等方面[1].目前，微生物發(fā)酵法生產(chǎn) L–色氨酸已經(jīng)走向?qū)嵱貌⑶姨幱谥鲗?dǎo)地位[2]，其中微生物發(fā)酵法具有產(chǎn)酸高、成本低、質(zhì)量好等優(yōu)勢(shì)，將是未來(lái)大規(guī)模生產(chǎn) L–色氨酸的首選技術(shù)[3].因此，建立一種快速且準(zhǔn)確的測(cè)定發(fā)酵液中 L–色氨酸的方法非常必要.

L–色氨酸的定性和定量測(cè)定方法有紙層析法、薄層分析法、比色法、高效液相色譜法、氨基酸分析儀測(cè)定法等[4–6].其中最常用的有對(duì)二甲胺基苯甲醛比色法和柱前衍生HPLC法.但這兩種方法操作步驟復(fù)雜，且分別以50%濃硫酸為顯色反應(yīng)介質(zhì)和用2，4–二硝基氟苯作為衍生劑，實(shí)驗(yàn)危險(xiǎn)性均很大.由于 L–色氨酸在紫外區(qū)有光吸收，因此本文建立了直接利用光電二極管陣列(DAD)檢測(cè)器在 278,nm 處測(cè)定發(fā)酵液中 L–色氨酸含量的 HPLC法，并與對(duì)二甲胺基苯甲醛比色測(cè)定法和柱前衍生HPLC法進(jìn)行了比較.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent,1200型高效液相色譜儀，包括 DAD檢測(cè)器、梯度四元泵、柱溫箱、在線自動(dòng)脫氣器，數(shù)據(jù)處理由化學(xué)工作站完成.L–色氨酸、L–酪氨酸、L–苯丙氨酸，色譜純，北京索萊寶科技有限公司；甲醇，色譜純，天津市元立化工有限公司；其他試劑為分析純.

1.2 方法

對(duì)二甲胺基苯甲醛比色法測(cè)定：見參考文獻(xiàn)[7].

2，4–二硝基氟苯衍生法測(cè)定：見參考文獻(xiàn)[8].

HPLC分析條件：色譜分離柱 Agilent C18(5,μm，150,mm×4.6,mm)，流動(dòng)相 V(0.03% KH2PO4溶液)∶V(甲醇)=90∶10，流量 1.0,mL/min，柱溫 39,℃，進(jìn)樣量 20,μL，檢測(cè)波長(zhǎng) 278,nm.

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：見參考文獻(xiàn)[9].

樣品處理：取 1.0,mL發(fā)酵液 10,000,r/min離心5,min，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)使 L–色氨酸濃度介于測(cè)定方法的檢測(cè)線性范圍內(nèi)，然后用 0.22,μm 微孔濾膜過濾，所得濾液直接進(jìn)樣測(cè)定.

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

L–色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，在紫外區(qū)下具有光吸收.由圖 1可知，其在 225,nm 和278 nm處均有吸收峰，則在DAD檢測(cè)器中設(shè)定兩個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)分別為 225,nm和 278,nm.質(zhì)量濃度為0.100,g/L的L–色氨酸標(biāo)樣在兩種檢測(cè)波長(zhǎng)處的高效液相色譜圖如圖2所示.

圖1 L–色氨酸紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption map of L-tryptophan

圖2 L–色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(0.100 g/L)高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of L-tryptophan(0.100 g/L)

由圖2可知，質(zhì)量濃度為0.100,g/L的L–色氨酸標(biāo)樣在 225,nm和 278,nm處的保留時(shí)間一致.但兩者的峰面積不同，分別為11,699.9和2,902.3，在 225 nm處檢測(cè)器的輸出信號(hào)約為 278,nm處輸出信號(hào)的4倍.由于檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)在一定范圍內(nèi)可與被測(cè)樣品的量呈一定的函數(shù)關(guān)系，若檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)超出一定范圍，輸出信號(hào)不能與樣品量呈一定線性關(guān)系[10]，則可推斷在 278,nm 處檢測(cè) L–色氨酸比在225,nm 處的線性范圍廣.圖 2(a)和圖 2(b)中 L–色氨酸的峰面積分別占相應(yīng)色譜圖中總峰面積的99.80%和 100.00%，說明在 225 nm 處 L–色氨酸標(biāo)樣中的雜質(zhì)有光吸收，而在278,nm處僅對(duì)L–色氨酸標(biāo)樣中的 L–色氨酸有光吸收.因此，選擇 278,nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng).

2.2 流動(dòng)相組成的篩選

采用0.03%,KH2PO4溶液-甲醇體系作為流動(dòng)相，為確定二者之間配比，設(shè)置體積比為 85∶15、88∶12、90∶10和92∶8四個(gè)體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3.

圖3 不同流動(dòng)相組成體系的色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of different mobile phases

由圖3可知，隨著流動(dòng)相體系中甲醇組分的增加，L–色氨酸的保留時(shí)間逐漸縮短.體系a與體系b不能將 L–色氨酸與其他雜質(zhì)分開，體系 c與體系 d的分離度(Rs)分別為 2.31、1.69，則選擇體系 c作為流動(dòng)相，即 V(0.03% KH2PO4溶液)∶V(甲醇)＝90∶10.

2.3 流動(dòng)相流量的確定

分別考察流量為 0.8,、1.0,、1.2,、1.4,mL/min 時(shí)發(fā)酵液的分離效果，由檢測(cè)結(jié)果可知，流量過小，分析時(shí)間延長(zhǎng)，柱效降低，而流量過大時(shí)，發(fā)酵液中物質(zhì)分離效果差，且由于壓力升高而損壞泵頭和色譜柱.綜合考慮，最終選定流量為1.0,mL/min.

2.4 柱溫對(duì)檢測(cè)的影響

柱溫對(duì)氨基酸的分離有較為明顯影響，為確定柱溫對(duì)發(fā)酵液中 L–色氨酸分離的影響.在 33、36、39、42,℃下各進(jìn)同一種樣品3次，結(jié)果見表1.由表1可知，隨著柱溫的升高，L–色氨酸和鄰近 L–色氨酸雜質(zhì)的保留時(shí)間均有所減少，同時(shí)柱效增強(qiáng)；柱溫為 39,℃時(shí)，分離度 Rs=2.17，兩個(gè)峰得到完全分離，因此采用柱溫為39,℃.

表1 溫度對(duì)L–色氨酸分離的影響Tab.1 Effect of temperature on chromatographic separationof L-tryptophan

2.5 色譜條件確定及其工作曲線

由以上實(shí)驗(yàn)確定HPLC檢測(cè)L–色氨酸的色譜條件為：流動(dòng)相 V(0.03% KH2PO4溶液)∶V(甲醇)＝90∶10，流量 1.0,mL/min，柱溫 39,℃，進(jìn)樣量 20,μL，檢測(cè)波長(zhǎng) 278,nm.在此條件下，HPLC 檢測(cè) L–色氨酸標(biāo)樣的色譜圖如圖 4所示.將不同質(zhì)量濃度的 L–色氨酸標(biāo)準(zhǔn)液在擬定色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，3組平行樣取其平均值，以 L–色氨酸濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)作圖可得一標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖5).

圖4 L–色氨酸(0.100.g/L)標(biāo)樣的HPLC圖Fig.4 HPLC chromatograms of L-tryptophan(0.100.g/L)

圖5 HPLC測(cè)定L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of L-tryptophan determination by HPLC

由圖4可見，L–色氨酸的響應(yīng)時(shí)間為6.015,min.由圖 5結(jié)果可知，在該色譜條件下 L–色氨酸質(zhì)量濃度在0.000～1.000,g/L線性關(guān)系良好.

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)和回收率實(shí)驗(yàn)

將 0.100,g/L的 L–色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液同濃度平行 3份，當(dāng)日重復(fù)進(jìn)樣 6次[11]，峰面積 RSD 為0.247%.在已知濃度的發(fā)酵液中分別加入一定量的L–色氨酸對(duì)照溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，具體添加量及結(jié)果見表 2，計(jì)算得出其相對(duì)回收率為98.93%.

表2 L–色氨酸檢測(cè)的回收率結(jié)果Tab.2 Results obtained in the recovery test of L-tryptophan

2.7 發(fā)酵液樣品的測(cè)定及不同檢測(cè)方法的比較

圖6是L–色氨酸發(fā)酵液HPLC測(cè)定色譜圖.

圖6 L–色氨酸發(fā)酵液HPLC測(cè)定色譜圖Fig.6 Chromatograms of L-tryptophan fermentation

由圖 6可知，色譜柱柱效較高，發(fā)酵液樣品中某些其他發(fā)酵成分能被檢測(cè)到且分離效果良好.與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照測(cè)得的發(fā)酵液中 L–色氨酸含量為32.8,g/L，這與對(duì)二甲胺基苯甲醛比色法、2，4–二硝基氟苯衍生測(cè)定法測(cè)得的 L–色氨酸含量相一致，從而證明該方法可以準(zhǔn)確地檢測(cè)發(fā)酵液中 L–色氨酸的含量.由表 3可知，該方法與對(duì)二甲胺基苯甲醛比色法、2，4–二硝基氟苯衍生測(cè)定法相比，線性關(guān)系更佳、穩(wěn)定性好、快速、危險(xiǎn)性小、操作步驟簡(jiǎn)單，且線性范圍可達(dá)0.000～1.000,g/L.

表3 L–色氨酸測(cè)定方法比較Tab.3 Comparison of determination methods for L-tryptophan

2.8 其他芳香族氨基酸的干擾

酪氨酸、苯丙氨酸與色氨酸同屬于芳香族氨基酸[12]，在 278,nm 處均有光吸收，則在上述擬定色譜條件下對(duì)酪氨酸、苯丙氨酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖 7所示.

圖7 酪氨酸與苯丙氨酸標(biāo)樣色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of tyrosine and phenylalanine

由圖7可知，酪氨酸與苯丙氨酸的保留時(shí)間分別為 1.982,min和 3.967,min，而色氨酸的保留時(shí)間為6.015,min，則說明酪氨酸與苯丙氨酸對(duì)發(fā)酵液中 L–色氨酸含量的測(cè)定沒有干擾，此檢測(cè)方法適用性強(qiáng).

3 結(jié) 論

HPLC 色譜條件：以 Agilent,C18(5,μm，150,mm×4.6,mm)為分離柱，V(0.03% KH2PO4溶液)∶V(甲醇)=90∶10為流動(dòng)相，流量為 1 mL/min，在 278 nm處 L–色氨酸可以很好地被檢測(cè)出來(lái)，保留時(shí)間為6.015 min，且酪氨酸、苯丙氨酸均對(duì)其測(cè)定沒有干擾，適用性強(qiáng).與對(duì)二甲胺基苯甲醛比色法和柱前衍生高效液相色譜法相比較，線性更佳、穩(wěn)定性好、快速、危險(xiǎn)性小、操作步驟簡(jiǎn)單，且線性范圍達(dá) 0.000～1.000,g/L，可有效應(yīng)用于發(fā)酵液中 L–色氨酸含量的測(cè)定.

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Quick Determination of L-Tryptophan in Fermented Broth by HPLC

CHENG Li-kun，XU Qing-yang，XIE Xi-xian，CHEN Ning
(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

A method to determine L-tryptophan in fermented broth was developed by high performance liquid chromatography(HPLC). An Agilent C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)was used with the mobile phase of 0.03% KH2PO4water solution and methanol(the ratio of volume was 90 to 10). The flow rate was at 1.0 mL/min and the detective wavelength was 278 nm. The method was rapid，accurate and simple with a good linearity(R2=0.999 9)in the range of 0.000 to 1.000 g/L for L-tryptophan. The average recovery was 98.93% with the relative standard deviation of 0.247%. The method was applicable for L-tryptophan determination in the fermented broth.

L-tryptophan；HPLC；determination

TQ922

A

1672-6510(2010)01-0009-04

2009-07-03；

2009-10-13

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)課題(2008ZX09401-05)；國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2008BAI63B01)

程立坤（1984—），男，山東濱州人，碩士研究生；通信作者：陳 寧，教授，ningch@tust.edu.cn.