孟小亮，陳昌福，吳志新，羅宇良 (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

嗜水氣單胞菌對(duì)鹽酸多西環(huán)素的耐藥性獲得與消失速率研究

孟小亮，陳昌福，吳志新，羅宇良 (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

在離體條件下測(cè)定了從人工養(yǎng)殖的斑點(diǎn)叉尾鮰患病魚(yú)體上分離的嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的4個(gè)菌株對(duì)鹽酸多西環(huán)素耐藥性獲得與消失的速率。結(jié)果表明：以25 ℃條件下培養(yǎng)72 h為1代，在含有鹽酸多西環(huán)素的藥物培養(yǎng)基中連續(xù)傳代9次后，鹽酸多西環(huán)素對(duì)A.hydrophila的最小抑制菌濃度(MIC)上升了31倍，MIC由0.05 mg/L上升至1.56 mg/L；而將已經(jīng)獲得高耐藥性的菌株以穿刺法接種在不含藥物的BHI(Difco)瓊脂培養(yǎng)基中，以4 ℃條件下保存20 d為1代，連續(xù)傳代5次，供試菌株的耐藥性呈現(xiàn)逐漸消失的趨勢(shì)，至第5次傳代后，其MIC由1.56 mg/L下降至0.10 mg/L。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)；鹽酸多西環(huán)素；耐藥性；獲得；消失

對(duì)人工養(yǎng)殖的斑點(diǎn)叉尾鮰能造成嚴(yán)重危害的致病菌種類較多。如嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)能引起細(xì)菌性敗血癥(haemorrhagic septicemia of channel catfish)，叉尾鮰愛(ài)德華菌(Edwardsiellaictaluri)能引起腸道敗血癥(enteric septicaemia of catfish，ESC)，柱狀嗜纖維菌(Cytophagacolumnaris)能引起柱形菌病(columnaris disease of channel catfish)等[1]。對(duì)于由致病細(xì)菌引起的疾病大多采用各種抗生素類藥物進(jìn)行治療[2]。但是，在同一個(gè)養(yǎng)殖水體中多次使用同種抗生素會(huì)導(dǎo)致病原菌耐藥性增加，使藥物治療斑點(diǎn)叉尾鮰的細(xì)菌性疾病變得越來(lái)越困難[3]。此外，抗菌藥物的大量使用還可能造成養(yǎng)殖魚(yú)體內(nèi)的藥物殘留超標(biāo)，甚至引起公共衛(wèi)生方面的問(wèn)題[4]。

各種致病菌對(duì)不同種類的抗生素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制不同，而且產(chǎn)生速度和消失速率也是有所不同的[5]。了解致病菌對(duì)抗生素的產(chǎn)生和消失速率，是決定抗生素藥物的使用程序和方法的基礎(chǔ)。在對(duì)人工養(yǎng)殖斑點(diǎn)叉尾鮰(IctaluruspunctatusRafinsque)的細(xì)菌性疾病治療的過(guò)程中，鹽酸多西環(huán)素是常用藥物，而由嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)引起的細(xì)菌性敗血癥是人工養(yǎng)殖斑點(diǎn)叉尾鮰的多發(fā)病。本研究在離體條件下，檢測(cè)了從患病斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)體上分離的A.hydrophila菌株對(duì)鹽酸多西環(huán)素的耐藥性獲得與消失速率，旨在為制定抗生素類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病治療中的科學(xué)用藥程序提供基礎(chǔ)資料。

表1 供試菌株的來(lái)源Table 1 Strains for test

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥物鹽酸多西環(huán)素(Oxytetracycline HCl)由Rochi生產(chǎn)，批號(hào)為081226。供試菌株為2007年6月至7月從湖北省長(zhǎng)陽(yáng)和宜都清江內(nèi)人工網(wǎng)箱飼養(yǎng)的患病斑點(diǎn)叉尾鮰分離的A.hydrophila的BH-002、BH-015、BH-017和BH-019 4個(gè)菌株。菌株分離的時(shí)間、地點(diǎn)和病魚(yú)器官詳細(xì)見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

(1)供試菌株最小抑菌濃度的測(cè)定 按照日本化學(xué)療法學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)法[6]，首先將鹽酸多西環(huán)素采用2倍稀釋法分別稀釋至1 000～0.25 mg/L的13個(gè)濃度。然后用FWA培養(yǎng)基[7]將各濃度的藥物液稀釋10倍，從而使培養(yǎng)基中各種藥物的濃度達(dá)到100～0.025 mg/L的2倍稀釋的13個(gè)濃度。最后向每支盛有3.0 mL FWA培養(yǎng)基的試管中加入0.10 mL濃度約為1.2×107cfu/mL活菌液(比濁法測(cè)定)，即最終細(xì)菌濃度為4×105cfu/mL。在25 ℃條件下培養(yǎng)72 h，經(jīng)肉眼觀察證實(shí)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的試管中的最低藥物濃度，即為藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。

(2)供試菌株耐藥性獲得速率的測(cè)定 在上述測(cè)定鹽酸多西環(huán)素對(duì)A.hydrophila的MIC的試管中，從肉眼觀察有細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度的試管中吸取0.1 mL培養(yǎng)基，將其接種在含有不同濃度鹽酸多西環(huán)素的FWA培養(yǎng)基試管中，在25 ℃條件下培養(yǎng)72 h，從經(jīng)肉眼觀察證實(shí)有細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度的試管中，吸取培養(yǎng)基分別按照前述的方法測(cè)定鹽酸多西環(huán)素對(duì)其中A.hydrophila的MIC。相同的操作連續(xù)進(jìn)行9次，使A.hydrophila在含有鹽酸多西環(huán)素的藥物培養(yǎng)基中傳代9次，將最后測(cè)定的MIC與最初的MIC比較，評(píng)價(jià)菌株對(duì)鹽酸多西環(huán)素耐藥性獲得速率。

(3)供試菌株耐藥性消失速率的測(cè)定 將在藥物培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代9次證明其均已經(jīng)獲得較高耐藥性的A.hydrophila4個(gè)菌株，以瓊脂內(nèi)穿刺法將菌株分別接種在盛有不含鹽酸多西環(huán)素的BHIA(Difco)培養(yǎng)基的試管中，在4 ℃條件下保存，每間隔20 d以同樣的方法傳代1次，連續(xù)傳代5次。按照前述的方法測(cè)定鹽酸多西環(huán)素對(duì)每次傳代后培養(yǎng)基中A.hydrophila的MIC。將對(duì)傳代5次后測(cè)定的MIC與最初的MIC比較，評(píng)價(jià)菌株對(duì)鹽酸多西環(huán)素耐藥性消除速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株對(duì)鹽酸多西環(huán)素的敏感性

鹽酸多西環(huán)素對(duì)A.hydrophila4個(gè)菌株MIC的測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可知，鹽酸多西環(huán)素對(duì)4個(gè)菌株的MIC均為0.10 mg/L。

表2 叉尾鮰愛(ài)德華菌對(duì)鹽酸多西環(huán)素的敏感性Table 2 Susceptibity of Edwardsiella ictaluri to oxytetracycline

注：“+”表示耐藥；“-”表示敏感。

2.2 供試菌株對(duì)鹽酸多西環(huán)素耐藥性獲得速率

A.hydrophila的4個(gè)菌株經(jīng)過(guò)連續(xù)9次在帶有鹽酸多西環(huán)素的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，菌株對(duì)鹽酸多西環(huán)素耐藥性變化的情況如表3所示。由表3可以看出，4個(gè)菌株在含有鹽酸多西環(huán)素的培養(yǎng)基中傳代9次后，均獲得了比較強(qiáng)的耐藥性，MIC由0.05 mg/L上升到了1.56 mg/L。

表3 叉尾鮰愛(ài)德華菌對(duì)鹽酸多西環(huán)素耐藥性獲得速率Table 3 Development of drug-resistance of Edwardsiella ictaluri to oxytetracycline

2.3 供試菌株對(duì)鹽酸多西環(huán)素耐藥性消失速率

表4 叉尾鮰愛(ài)德華菌對(duì)鹽酸多西環(huán)素耐藥性消失速率Table 4 Reversion of acquired drug-resistanceof Edwardsiella ictaluri to oxytetracycline

將獲得了較強(qiáng)耐藥性A.hydrophila的4個(gè)菌株在不含鹽酸多西環(huán)素的BHIA(Difco)培養(yǎng)基中連續(xù)5次傳代培養(yǎng)后，菌株對(duì)鹽酸多西環(huán)素耐藥性變化的狀況如表4所示。由表4可以看出，4個(gè)菌株在不含有鹽酸多西環(huán)素的培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)傳代5次，耐藥性逐漸消失，MIC由1.56 mg/L下降到了0.10 mg/L。

3 討論

在我國(guó)，現(xiàn)在已經(jīng)有比較多的抗生素類藥物被批準(zhǔn)作為水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的治療藥物(已經(jīng)獲得農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)生產(chǎn)的抗生素類漁藥達(dá)到25種)。但是，這些藥物從漁藥生產(chǎn)企業(yè)用于申請(qǐng)生產(chǎn)許可證的技術(shù)資料，到漁藥被水產(chǎn)養(yǎng)殖者使用的各個(gè)環(huán)節(jié)都還存在一些問(wèn)題。如漁藥企業(yè)在申請(qǐng)生產(chǎn)某種抗生素藥類漁藥時(shí)，所提供的申請(qǐng)技術(shù)資料大多只有藥物對(duì)某些水產(chǎn)動(dòng)物致病菌的抑、殺菌效果的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而沒(méi)有提供藥物的在對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物使用的過(guò)程中，致病菌對(duì)藥物耐藥性產(chǎn)生變化的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；又如由于我國(guó)的水產(chǎn)獸醫(yī)制度尚未建立起來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者在選擇某種漁藥作為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病治療藥物時(shí)，因?yàn)闆](méi)有針對(duì)致病菌(從需要用藥的患病水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)分離的致病菌)的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為選擇漁藥和使用劑量的依據(jù)，就只能根據(jù)漁藥生產(chǎn)企業(yè)提供的使用說(shuō)明書(shū)選擇藥物和決定藥物的使用劑量。

然而，致病菌對(duì)抗生素類藥物的敏感性是可以隨著接觸藥物次數(shù)而變化的，接觸某種抗生素的次數(shù)越多，致病菌對(duì)這種抗生素產(chǎn)生耐藥性就越強(qiáng)[8]。楠田等[8]在五條鰤(Seriolaquinqueradiata)養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)分離大量的殺魚(yú)巴斯德菌(Pasteurellapiscicida)菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定結(jié)果表明，該菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生的耐藥性程度是不相同的。楠田等[9]利用離體培養(yǎng)的方法觀察P.piscicida對(duì)安比西林(ampicillin)和氯霉素(chloramphenicol)耐藥性獲得與消失速率的結(jié)果表明，P.piscicida在含有藥物的培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)10次傳代培養(yǎng)，供試菌對(duì)安比西林的耐藥性上升了4～8倍，而對(duì)氯霉素的耐藥性上升了4倍。本研究觀察了A.hydrophila對(duì)鹽酸多西環(huán)素耐藥性在離體培養(yǎng)過(guò)程中的變化，結(jié)果證明A.hydrophila在含有鹽酸多西環(huán)素培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)9次傳代后，供試菌株對(duì)鹽酸多西環(huán)素的耐藥性就上升了31倍。這究竟是因?yàn)锳.hydrophila容易對(duì)抗生素藥物產(chǎn)生耐藥性，還是鹽酸多西環(huán)素容易誘導(dǎo)A.hydrophila等水產(chǎn)動(dòng)物致病菌耐藥性的生成，尚值得進(jìn)一步研究。

為了避免水產(chǎn)動(dòng)物致病菌產(chǎn)生耐藥性，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者在選擇抗生素類藥物作為治療水產(chǎn)動(dòng)物傳染性疾病治療藥物時(shí)，應(yīng)該從患病動(dòng)物體內(nèi)分離致病菌并測(cè)定致病菌對(duì)擬選藥物的敏感性，只有在獲得各種抗生素類藥物對(duì)致病菌的MIC的基礎(chǔ)上，漁藥的使用者才有可能做到正確選擇藥物和決定藥物的準(zhǔn)確用量，否則，就有可能因?yàn)椴恢乐虏【鷮?duì)不同種類抗生素耐藥性的變化背景，而造成實(shí)際上的盲目用藥。

水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的傳染性疾病一旦發(fā)生，病程發(fā)展速度就比較快，而從患病魚(yú)體中分離病原菌并完成藥物敏感測(cè)定的試驗(yàn)是需要一定的時(shí)間的，養(yǎng)殖業(yè)者往往擔(dān)心做這樣的試驗(yàn)會(huì)貽誤對(duì)疾病治療的時(shí)機(jī)。為了防止這種情況的發(fā)生，養(yǎng)殖業(yè)者可以通過(guò)做好養(yǎng)殖日記的方法，避免將同類抗生素類藥物在同一個(gè)養(yǎng)殖環(huán)境中多次使用，當(dāng)飼養(yǎng)的水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)生疾病時(shí)可以選擇與以前選用的藥物不同而且致病菌不會(huì)產(chǎn)生交叉耐藥性的藥物；也可以在養(yǎng)殖過(guò)程中定期檢測(cè)養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)攜帶的致病菌對(duì)各種抗生素類藥物敏感性的變化，只有掌握了養(yǎng)殖水體和水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)致病菌對(duì)各種藥物耐藥性的變化狀況，才有可能做到對(duì)癥用藥和科學(xué)用藥，否則，用藥種類的選擇、劑量的控制以及用藥程序的決定等就必然會(huì)帶有盲目性。

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2008-11-13

農(nóng)業(yè)部疫情檢測(cè)項(xiàng)目(2130108);農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(200803013)

孟小亮(1984-)，男，江蘇宿遷人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖和魚(yú)病防治研究.

陳昌福，E-mail: chenchangfu@mail.hzau.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.01.013

S917.1

A

1673-1409(2009)01-S042-03