何明祥 (福建省福清市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，福建 福清 350300)

沙丁胺醇時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)技術(shù)的研究

何明祥 (福建省福清市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，福建 福清 350300)

采用包被二抗間接競(jìng)爭(zhēng)法，以抗SAL二抗體包被96微孔板作為固相二抗,與游離SAL間接競(jìng)爭(zhēng)限量的以Eu3+標(biāo)記的SAL-OVA抗原,建立解離增強(qiáng)模式的熒光免疫分析體系檢測(cè)沙丁胺醇(SAL)，以利用時(shí)間分辨熒光免疫分析( TRFIA) 技術(shù)建立快速、高靈敏度的沙丁胺醇(SAL) 全自動(dòng)檢測(cè)方法。結(jié)果表明該法的靈敏度為0.04 ng/mL,批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為2.2%和8.7%,平均回收率為106.5%,與鹽酸克倫、萊克多巴胺的交叉反應(yīng)率分別為0.93%和0.73%。由此可見(jiàn)，用TRFIA法檢測(cè)SAL， 靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好,具有良好的應(yīng)用前景。

沙丁胺醇；檢測(cè)技術(shù)；時(shí)間分辨熒光免疫分析

沙丁胺醇(Salbutamol,SAL)又名舒喘寧，是一種人工合成的β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，對(duì)心臟有刺激，久用會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心率失常，甚至猝死，對(duì)人類(lèi)健康有一定危害。加大使用劑量后，能增強(qiáng)對(duì)呼吸系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的刺激，提高其速度，可作為興奮劑使用[1]。20世紀(jì)80年代研究表明β2-興奮劑，此類(lèi)藥物對(duì)動(dòng)物具有促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)、減少脂肪蓄積、提高胴體部分肉脂比的營(yíng)養(yǎng)再分配作用，因而被國(guó)內(nèi)外不少養(yǎng)殖場(chǎng)非法用作飼料添加劑，其中鹽酸克倫特羅(CBL)和沙丁胺醇是最常被濫用的2種。隨著各國(guó)政府對(duì)CBL監(jiān)控力度的加大，不法分子不得不尋找新的替代品，SAL成為繼CBL之后的營(yíng)養(yǎng)再分配劑的首選品[2]。近年來(lái)，動(dòng)物性產(chǎn)品中SAL 殘留對(duì)人類(lèi)健康造成的危害和對(duì)生態(tài)食物鏈所造成的破壞已經(jīng)引起高度重視，關(guān)于CBL、SAL殘留引起的中毒事件和負(fù)面影響事件不勝枚舉[3]，深入了解SAL在動(dòng)物體內(nèi)的代謝、吸收、殘留特點(diǎn)及SAL殘留檢測(cè)方法對(duì)廣大消費(fèi)者、研究人員及執(zhí)法部門(mén)具有重要意義[4]。

目前,檢測(cè)SAL 殘留的方法主要有：高效液相色譜法(HPLC) 、氣相色譜-質(zhì)譜法(CG-MS) 、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS) 、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CE)以及免疫分析方法(IA)[5]。儀器檢測(cè)法精度高，且假陽(yáng)性率低；但是存在樣品前處理繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、需要貴重儀器、難于操作、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。免疫分析法檢測(cè)特異性好、靈敏度高。目前用于檢測(cè)SAL的免疫分析技術(shù)主要有放射免疫分析技術(shù)(RIA) 、膠體金免疫分析(ICG) 、酶免疫分析(EIA) 、免疫親和色譜法(IAC) 以及生物傳感器檢測(cè)法(BS) 等，但均存在著缺點(diǎn)。時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)法(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA) 用三價(jià)稀土離子及其螯合物作為示蹤物,代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì),標(biāo)記抗原、抗體、核酸探針等物質(zhì)。當(dāng)免疫反應(yīng)發(fā)生后,根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度比值,判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度,達(dá)到定量分析的目的[6]。該方法具有測(cè)量靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、示蹤物穩(wěn)定、定量分析量程寬、無(wú)放射性污染和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn),因此越來(lái)越多地應(yīng)用于疾病診斷、療效觀察等醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[7],但在食品安全監(jiān)控方面的應(yīng)用甚少。因此,筆者采用Eu3+標(biāo)記的抗SAL 單克隆抗體,開(kāi)展了SAL時(shí)間分辨熒光免疫分析方法的研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺含量均大于99%，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院提供；SAL-卵血清蛋白偶合物、抗SAL單克隆抗體為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室自制； 96 孔微量反應(yīng)板為雷博公司產(chǎn)品；純化離心柱(30 ku) 為美國(guó)Minipore 公司產(chǎn)品；陰性豬尿樣為廣州市獸藥監(jiān)督所提供；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

恒溫振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司;1-13 型快速離心機(jī)：Sigma 公司;1575 型洗板機(jī)：Bio-RAD 公司;微量可調(diào)移液槍?zhuān)杭獱柹?微量振蕩器：江蘇康健醫(yī)療用品有限公司;1235 型TRFIA 全自動(dòng)分析儀：Wallac 公司。

1.2 方法

(1)SAL標(biāo)準(zhǔn)液的配制 SAL以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制成質(zhì)量濃度為20 μg/mL的溶液,稀釋到500 ng/mL作為貯備液,使用前配成質(zhì)量濃度梯度為0、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL 的SAL標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

(2)SAL 抗原的純化及標(biāo)記 將0.5 mg SAL-OVA抗原加入到純化離心柱中,8 000 r/min離心5～6 min,加入200 μL 標(biāo)記緩沖液,離心、棄濾液,再加入200 μL 標(biāo)記緩沖液,按上述方法離心重復(fù)5 次。將離心后的離心管取出,棄濾液,再將離心柱反轉(zhuǎn),2 000～3 000 r/min 離心1 min,收集濾液,即為待標(biāo)記抗原。銪標(biāo)記抗原的方法參照文獻(xiàn)[7]。

(3)抗SAL單克隆抗體(第二抗體)最佳包被濃度的選擇 將二抗以PBS緩沖液分別稀釋至2、5、10、15 μg/mL，每一濃度作一橫列，4 ℃冰箱過(guò)夜，次日室溫平衡后洗板1次，以封閉液室溫封閉1 h，洗板3次，于無(wú)塵吸水紙上拍干，不同濃度的包被板中每孔加入50 μL系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品和100 μL銪標(biāo)記抗原溶液(以分析緩沖液稀釋200倍)及100 μL抗SAL單克隆抗體(以分析緩沖液稀釋1 000倍)，每孔作一重復(fù)，室溫振蕩1 h，洗板6次拍干，加增強(qiáng)液200 μL，振蕩5 min，測(cè)熒光值作曲線(xiàn)，確定二抗最佳包被濃度。

(4)銪抗原最佳稀釋倍數(shù)的選擇 以二抗最佳包被濃度包被的固相二抗板，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品和分別稀釋100、200、400、800倍的銪標(biāo)記抗原溶液100 μL及抗SAL單克隆抗體100 μL(以分析緩沖液稀釋1 000倍)，以下操作同(3)，確定銪抗原最佳稀釋倍數(shù)。

(5)抗SAL單克隆抗體最佳稀釋倍數(shù)的選擇 以二抗最佳包被濃度的包被板，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品和100 μL最佳稀釋倍數(shù)的銪標(biāo)記抗原溶液及100 μL分別稀釋300、600、1 200、2 400倍的SAL單克隆抗體溶液，以下操作同(3)，確定抗SAL單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

(6)最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇 在包被好的板條中,加入系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μL 和100 μL最佳稀釋倍數(shù)抗SAL單克隆抗體溶液及最佳稀釋度的銪標(biāo)抗原溶液200 μL,室溫分別孵育0.5、1.0、1.5、2.0 h,以下操作同(3),確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

一步法：以二抗最佳包被濃度的包被板，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品和100 μL最佳稀釋倍數(shù)的銪標(biāo)記抗原溶液及100 μL最佳稀釋倍數(shù)的SAL單克隆抗體溶液，以下操作同(3)。

二步法：以二抗最佳包被濃度的包被板，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品和100 μL最佳稀釋倍數(shù)的SAL單克隆抗體溶液，室溫振蕩反應(yīng)1 h后，再加入100 μL最佳稀釋倍數(shù)的銪標(biāo)記抗原溶液，再次室溫振蕩反應(yīng)1 h后，洗板，加增強(qiáng)液，最后測(cè)熒光值作抑制曲線(xiàn)。

(7)抗原稀釋液的選擇 分別以Tris-HCl(pH7.2，0.01 mol/L) 、PBS(pH 6.0，0.01 mol/L) 、PBS(pH7.0，0.01 mol/L) 、PBS(pH 8.0，0.01 mol/L) 4 種緩沖液將銪標(biāo)抗原稀釋相同的倍數(shù),室溫孵育1.0 h,以下操作同(3),確定最佳稀釋液。

(8)最佳反應(yīng)體系的選擇 在包被好的板條中,分別加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL 和銪標(biāo)記抗原100 μL,即150 μL 反應(yīng)體系(體系Ⅰ);標(biāo)準(zhǔn)品100 μL 和銪標(biāo)抗原100 μL,即200 μL 反應(yīng)體系(體系Ⅱ);加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL 和銪標(biāo)記抗原200 μL,即250 μL 反應(yīng)體系(體系Ⅲ),室溫孵育1.0 h,洗板拍干后,根據(jù)各反應(yīng)體系的最終反應(yīng)體積分別加入增強(qiáng)液150 μL 和200 μL,振蕩5 min 后測(cè)熒光值,作曲線(xiàn),確定最佳反應(yīng)體系。

(9)TRFIA 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立、樣品測(cè)定及考核 采用最佳條件操作,在1235 型TRFIA 全自動(dòng)分析儀上測(cè)熒光值,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。同時(shí),作SAL 為零濃度的孔12個(gè),以零劑量點(diǎn)計(jì)數(shù)率(cps) 均值減2 s后的計(jì)數(shù)率在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上得到的相應(yīng)濃度值為檢測(cè)的靈敏度[8]。將高、中、低3 個(gè)已知濃度的SAL標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加到陰性尿樣中,檢測(cè)后計(jì)算添加回收率,各測(cè)3 次,計(jì)算平均值。計(jì)算公式為：

加標(biāo)回收率(%) = (分析樣品測(cè)得量-陰性樣品測(cè)得量) /加標(biāo)量×100

以系列濃度的SAL 及沙丁胺醇、萊克多巴胺兩種近似抗原分別作競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn),計(jì)算各自的結(jié)合率,求出各自在IC50時(shí)的濃度,按下式計(jì)算交叉反應(yīng)率。

交叉反應(yīng)率(%)=IC50時(shí)抗原濃度/IC50時(shí)近似抗原物質(zhì)的濃度×100

方法的精密度以批內(nèi)誤差和批間誤差來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1抗SAL單克隆抗體(第二抗體)最佳包被濃度的選擇

圖1 不同二抗包被濃度的TRFIA抑制曲線(xiàn)Figure 1 TRFIA’s inhibitory curves for different coating concentration of secondary antibodies

圖2 不同銪標(biāo)記抗原稀釋度的TRFIA抑制曲線(xiàn)Figure 2 TRFIA’s inhibitory curves for different antigens dilutions with labels

不同二抗包被濃度下的TRFIA抑制曲線(xiàn)如圖1所示，10 μg/mL和15 μg/mL的包被濃度下，IC50分別為4.8、4.6 ng/mL，考慮到實(shí)際應(yīng)用中的成本，選擇10 μg/mL為二抗最佳包被濃度。

2.2 銪抗原最佳稀釋倍數(shù)的選擇

不同銪標(biāo)記抗原稀釋度條件下，TRFIA抑制曲線(xiàn)如圖2所示，400和800倍稀釋時(shí)，IC50較好，為8.7 ng/mL，且沒(méi)有差異。但800倍稀釋時(shí)，熒光值偏低，選擇400倍稀釋為銪標(biāo)記抗原的最佳濃度。

2.3 抗SAL單克隆抗體最佳稀釋倍數(shù)的選擇

不同抗SAL單克隆抗體濃度條件下，TRFIA抑制曲線(xiàn)如圖3所示，1 200和2 400倍稀釋時(shí)，IC50分別為4.07和3.29 ng/mL。但抗體2 400倍稀釋時(shí)，熒光值過(guò)低，故選擇1 200為抗體最佳稀釋倍數(shù)。

2.4 最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇

不同反應(yīng)時(shí)間所得到的抑制率如表1 所示。雖然室溫孵育0.5 h 與孵育1.0 h 計(jì)算得到的抑制率相差不大,但孵育1.0 h 后熒光值趨于穩(wěn)定(熒光值略),說(shuō)明反應(yīng)充分,故選擇反應(yīng)時(shí)間為1.0 h。

表1 不同反應(yīng)時(shí)間的TRFIA抑制率Table 1 The TRFIA’s inhibitory rate ofdifferent reaction times

一步法同二步法的TRFIA抑制曲線(xiàn)如圖4所示，經(jīng)比較，兩者的IC50在0.05置信區(qū)間內(nèi)無(wú)顯著差異，所以可選擇一步法作為最佳反應(yīng)方式。

2.5 抗原稀釋液的選擇

本實(shí)驗(yàn)抗原抗體反應(yīng)對(duì)pH 值較為敏感,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示。pH 中性條件下反應(yīng)充分,IC50較理想。故宜選擇pH 7.0(0.01 mol/L)的PBS作抗原稀釋液。

2.6 最佳反應(yīng)體系的選擇

結(jié)果見(jiàn)圖6所示,體系Ⅰ(A)與體系Ⅲ(C)抑制效果相差不大,但體系Ⅲ各點(diǎn)熒光值較低(熒光值略)，主要是因?yàn)镾AL 標(biāo)準(zhǔn)液的增加使游離SAL 與抗SAL單克隆抗體結(jié)合的機(jī)會(huì)增加,因而結(jié)合在固相二抗上的SAL單克隆抗體減少,熒光值相應(yīng)就會(huì)降低。故選用體系Ⅰ為最佳反應(yīng)體系。

圖3 不同抗SAL單克隆抗體稀釋度的TRFIA抑制曲線(xiàn)Figure3 TRFIA’sinhibitorycurvesfordifferentSALmonoclonalantibodiesdilutions圖4 不同溫育時(shí)間的TRFIA抑制曲線(xiàn)Figure4 TRFIA’sinhibitorycurvesfordifferentincubationtimes圖5 不同單抗稀釋液的TRFIA曲線(xiàn)Figure5 TRFIAcurvesfordifferentantibodydilution圖6 不同反應(yīng)體系的TRFIA曲線(xiàn)Figure6 TRFIAcurvesfordifferentreactingsystems

2.7 TRFIA 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立、樣品測(cè)定及考核

圖7 TRFIA最佳模式檢測(cè)SAL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure 7 The standard curve of SAL with TRFIA test under optimum mode

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度調(diào)整為0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 ng/mL,曲線(xiàn)的線(xiàn)性好,故標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)采用以上各濃度點(diǎn)。最佳條件下,在Wallac1235 型TRFIA 全自動(dòng)分析儀上得到TRFIA法測(cè)定SAL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),如圖7 所示。

(1)靈敏度 間接競(jìng)爭(zhēng)TRFIA 測(cè)SAL方法的靈敏度為0.04 ng/mL,曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.99 以上,說(shuō)明方法的線(xiàn)性關(guān)系較好。

(2) 精密度和特異性 TRFIA 檢測(cè)SAL 方法在0～10 ng/mL 質(zhì)量濃度之間的批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為2.2%和8.7%,與沙丁胺醇、萊克多巴胺交叉反應(yīng)率分別為0.93%和0.73%,說(shuō)明方法精密度良好，特異性強(qiáng)。

(3) 加標(biāo)回收率 由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)得的結(jié)果,計(jì)算得到方法的平均加標(biāo)回收率為106.5%,如表2所示。

表2 TRFIA檢測(cè)SAL方法的加標(biāo)回收率Table 2 The recovery with standardaddition of SAL method with TRFIA test

3 小結(jié)與討論

本研究以沙丁胺醇為研究對(duì)象，采用包被抗原間接競(jìng)爭(zhēng)法，建立了時(shí)間分辨熒光免疫分析的檢測(cè)方法。經(jīng)試驗(yàn)，其最佳條件為：以10 μg/mL 抗SAL單克隆抗體(第二抗體)包被96微孔板作為固相二抗，SAL標(biāo)準(zhǔn)品50 μL、Eu3+標(biāo)記抗原(400倍稀釋) 100 μL競(jìng)爭(zhēng)限量抗SAL單克隆抗體(1 200倍稀釋)100 μL與固相二抗結(jié)合成免疫復(fù)合物，一步反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間1 h，反應(yīng)體系緩沖液采用PBS(pH 7.0)，建立解離增強(qiáng)模式的熒光免疫分析體系檢測(cè)SAL。該方法的靈敏度為0.04 ng/mL，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為2.2%和8.7%，平均回收率為106.5%，與鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺的交叉反應(yīng)率分別為0.93%和0.73%，方法特異性良好。

采用TRFIA 技術(shù)進(jìn)行SAL檢測(cè)的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)采用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS) 方法作為SAL的確證方法,此法最低檢測(cè)限為1.0 ng/mL;毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CE) 以及放射免疫分析技術(shù)(RIA) 最低檢測(cè)限為0.5 ng/mL[9];直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)SAL殘留量,最低檢測(cè)限為0.05 ng/g; 本研究建立的TRFIA方法靈敏度為0.04 ng/mL,且反應(yīng)時(shí)間僅需1 h,操作步驟簡(jiǎn)便。

TRFIA 是以熒光讀數(shù)為分析基礎(chǔ),零劑量SAL的熒光值越高,靈敏度提高的可能性就越大。由于采用以銪直接標(biāo)記SAL-OVA抗原,要提高熒光值就必須提高銪標(biāo)SAL-OVA抗原的量,而對(duì)于固相二抗和游離抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體上的結(jié)合位點(diǎn)來(lái)說(shuō),抗原量的增加有可能減弱這種競(jìng)爭(zhēng)力,對(duì)方法的靈敏度產(chǎn)生不利影響,所以如何在保持高靈敏度的條件下提高熒光值,還需要從銪標(biāo)記效率的提高以及增強(qiáng)液的質(zhì)量或競(jìng)爭(zhēng)分析模式方面作進(jìn)一步的研究。

[1]李 穎.沙丁胺醇單克隆抗體的制備與ELISA檢測(cè)方法的初步建立[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[2]朱紹棠,徐友宣,張建麗.禁用藥物β_2-激動(dòng)劑的分析研究[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2003，2(5)：47～50，70.

[3]潘利華，孫文偉. 固相時(shí)間分辨熒光免疫標(biāo)記技術(shù)研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2004，24(12)：1601～1604.

[4]Harma H,Lovgren T,Lovgren T. Europium nanoparticles and time-resolved fluorescence for ultrasensitive detection of prostate-specific antigen[J]. Clinical Chemistry，2001，47：561～568.

[5]雷紅濤,高秀潔,潘 科,等.鹽酸克倫特羅時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2006，3(6):6～10.

[6]李振甲,陳泮藻,高 平,等.時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)與應(yīng)用[J].北京:科學(xué)出版社，1996.102～103.

[7]田 振,郭周義,賈雅麗.時(shí)間分辨熒光免疫分析及其在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用[J].激光生物學(xué)報(bào)，2002,11(4):290～295.

[8]王永成,唐 棣,常文保,等.時(shí)間分辨熒光免疫分析法間接測(cè)定雌二醇[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2001,17(2):89～93.

[9]黃 飚,陶文沂,張蓮芬,等.赭曲霉毒素A的高靈敏時(shí)間分辨熒光免疫分析[J].生物化學(xué)與生物物理，2005,32(7):662～666.

[10]劉 欣.人尿中沙丁胺醇的測(cè)定[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1994,29(6)：454～458.

[11]陳 孝,趙香蘭.一種簡(jiǎn)易的檢測(cè)人體血漿中沙丁胺醇濃度的HPLC法[J].藥物分析雜志，1998,12(2)：98～100.

[12]袁利鵬，孫遠(yuǎn)明，雷紅濤,等.沙丁胺醇人工抗原合成及鑒定研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2006,27(12)：276～279.

2008-10-10

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z447)

何明祥(1976-)，男，福建福清人，工學(xué)碩士，工程師，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè).

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.01.011

X836;X839.2

A

1673-1409(2009)01-S033-05