高華榮 孫相民

【關(guān)鍵詞】 指紋圖譜;中藥制劑;原料藥

中藥是中國人民數(shù)千年積累的財富,隨著國際醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)競爭日益激烈,對傳統(tǒng)中藥產(chǎn)業(yè)提出了現(xiàn)代化和國際化的要求,這就要求我們傳統(tǒng)中藥的質(zhì)量控制方法也要更加完善,只有這樣才能讓中藥走向國際市場。

中藥為多成分體系,其藥效是眾多單一的活性化學(xué)成分的協(xié)同綜合作用,甚至某些“非活性成分”也起重要的協(xié)同作用,體現(xiàn)了中醫(yī)理論“整體觀念”和“辨證施治”的精髓,因此,利用中藥指紋圖譜質(zhì)量評價體系分析中藥成分的整體特性是目前大家所關(guān)注的。

1 中藥指紋圖譜的概念和分類

1.1 概念 中藥指紋圖譜是指某種(或某產(chǎn)地)中藥材或中成藥經(jīng)適當(dāng)?shù)奶幚砗?采用一定的分析手段,得到的能夠標(biāo)志該中藥材或中成藥特征的色譜或光譜的圖譜。指紋圖譜的作用主要是反映復(fù)雜成分的中藥及其制劑內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。廣義的中藥指紋圖譜包括化學(xué)指紋圖譜和DNA指紋圖譜,狹義的指紋圖譜僅指化學(xué)指紋圖譜。本文所指的中藥指紋圖譜指前者,它是目前國內(nèi)外廣泛接受的一種中藥質(zhì)量控制模式和技術(shù),同時也是中藥理論研究與新藥開發(fā)的研究模式和體系。

1.2 分類 ①按應(yīng)用對象分類:可分為中藥材(原料藥材)指紋圖譜、中藥原料藥(包括飲片、配伍顆粒)指紋圖譜和中藥制劑指紋圖譜。中藥材指紋圖譜按測定手段又可分為化學(xué)(成分)指紋圖譜和DNA指紋圖譜[1];②按測定手段分類:可分為中藥化學(xué)(成分)指紋圖譜和中藥生物指紋圖譜。中藥化學(xué)(成分)指紋圖譜系指采用光譜、色譜和其他分析方法建立的用以表征中藥化學(xué)成分的特征的指紋圖譜。光譜最常用的是紅外光譜(IR)。色譜最常用的是薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)和毛細(xì)管電泳(CE)。其他方法包括波譜[質(zhì)譜(MS)和核磁共振譜(NMR)]和聯(lián)用技術(shù)[25]。

2 中藥指紋圖譜在控制原料藥材質(zhì)量中的地位和重要性

國際社會對藥品的要求是“安全、有效、經(jīng)濟(jì)”,對于中成藥這樣的物質(zhì)群的質(zhì)量控制方法近20年來也日趨共識[6]。WHO草藥評價指導(dǎo)原則中規(guī)定,如果草藥的活性成分不能鑒別,可以通過色譜指紋圖譜證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致。中國國家食品藥品監(jiān)督管理局要求到2002年末,所有申報的中藥注射劑均應(yīng)有相關(guān)的指紋圖譜資料,包括中藥原料、提取物、產(chǎn)品,3種圖譜的峰形必須有相關(guān)性,否則不予受理。這對推動中藥現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化和國際化具有重大作用,可確立中藥在國際醫(yī)藥學(xué)界應(yīng)有的地位。

中藥化學(xué)成分的多樣性和復(fù)雜性是發(fā)揮其療效的物質(zhì)基礎(chǔ),同時也是質(zhì)量評價的重點(diǎn)與難點(diǎn)。在現(xiàn)階段,建立全面反映所含化學(xué)成分的指紋圖譜,將更有效的體現(xiàn)中藥成分的復(fù)雜性,從而更好的評價中藥的質(zhì)量[7]。

3 研究實(shí)施中藥指紋圖譜的重要環(huán)節(jié)是制劑工藝的規(guī)范和優(yōu)化

中國衛(wèi)生部原頒發(fā)的藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的許多老產(chǎn)品和新的三類中成藥產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝大部分簡單粗糙,既難以保證產(chǎn)品的穩(wěn)定,更無法提供高質(zhì)量產(chǎn)品,必然對指紋圖譜研究增加困難。中藥注射劑由于劑型的需要,生產(chǎn)工藝相對精細(xì),“雜質(zhì)”相對較少,但工藝是否穩(wěn)定還是需要注意的問題。歐洲草藥制劑的生產(chǎn)工藝大多以“標(biāo)準(zhǔn)浸膏”投料[8],減少了以草藥作起始原料帶來的不穩(wěn)定因素,甚至有廠家專門生產(chǎn)多種草藥的“標(biāo)準(zhǔn)浸膏”提供給制劑廠。每種浸膏均附有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),或按照制劑廠家的要求生產(chǎn)“標(biāo)準(zhǔn)浸膏”。將來至少中藥注射劑的工藝將藥材投料改為浸膏投料是不可避免的;以有效部位投料可能也是一種趨勢。

4 中藥指紋圖譜在制劑中的應(yīng)用

4.1 光譜法

4.1.1 紫外光譜法(UV) 紫外吸收光譜主要用于化合物結(jié)構(gòu)鑒定和含量測定。李守信等[11]采用二階導(dǎo)數(shù)光譜法測定抗感顆粒中氯原子的含量。

4.1.2 紅外光譜法(IR) 屬于分子振動光譜,是有機(jī)分子的吸收光譜,可提供分子中有關(guān)官能團(tuán)的內(nèi)在信息,“指紋”對異構(gòu)體有選擇性,可進(jìn)行定量及無損分析。虞科等[9]提出一種近紅外漫反射光譜快速測定復(fù)方丹參滴丸有效成分的新方法,采用HPLC為對照分析法,對未知樣本進(jìn)行含量測定,可用于中藥復(fù)方制劑有效成分的快速檢測。

4.2 色譜法

4.2.1 薄層色譜法(TLC) 薄層色譜指紋圖譜用固定波長對薄層展開的各斑點(diǎn)進(jìn)行掃描,所得的掃描圖譜比目測的層析圖譜更客觀準(zhǔn)確,具有快速,經(jīng)濟(jì),可靠,操作簡便,適用范圍廣,重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。它的主要不足是“柱效”較低[10],對靠細(xì)微特征方可鑒別的指紋特征靈敏度也不夠,對外部環(huán)境條件(溫度,濕度)要求較高,操作要求規(guī)范,熟練。

4.2.2 高效液相色譜法(HPLC) 高效液相色譜法是運(yùn)用較多的分析方法,60%～70%的有機(jī)物均可應(yīng)用。高效液相色譜法與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用,能夠?qū)⑽粗煞值母鞣暹M(jìn)行歸屬。張力新等[11]用高效液相色譜法對腎康注射液中的主要大黃進(jìn)行分析,確定了大黃藥材的指紋圖譜分析方法。

4.2.3 氣相色譜法(GC) 氣相色譜法具有高效,高選擇性,高靈敏度,進(jìn)樣量小且分析速度快等優(yōu)點(diǎn),但樣品必須具有一定揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性,因此限制了其應(yīng)用范圍,其主要應(yīng)用于一些揮發(fā)性成分的鑒定。氣相色譜倉肝仆計字饕應(yīng)用于含揮發(fā)性成分較多的中藥材及中藥制劑的質(zhì)量鑒定和質(zhì)量控制。馮毅凡等[12]對華佗再造丸及其主要藥味紅花、川芎、當(dāng)歸、天南星、冰片、吳茱萸的石油醚提取物進(jìn)行了氣相色譜分析,獲取了其GC指紋圖譜,并根據(jù)其指紋特征對華佗再造丸進(jìn)行質(zhì)量評價。

4.2.4 高速逆流色譜法(HSCCC) HSCCC是當(dāng)前國際流行的新型的液慘悍峙浼際,具有很好的適應(yīng)性。其分離度和重現(xiàn)性與HPLC基本相同,但它操作更為簡便,容易掌握,對樣品的預(yù)處理要求低,僅需一般粗提物即可,該技術(shù)的回收率高,能實(shí)現(xiàn)梯度操作,易能重復(fù)進(jìn)樣。沈平孃[13]利用HSCCC技術(shù)對多種中藥進(jìn)行了指紋分析都得到了較好效果,可用于中藥的質(zhì)量控制和分析。

4.2.5 高效毛細(xì)管電泳法(HPCE) 本法具有分離模式多,分離效率高,速度快,適用范圍廣,所需樣品量和試劑量少等優(yōu)點(diǎn)。戴開金等[14]采用HPCE構(gòu)建了黃連藥材及葛根蘇連湯中黃連生物堿的指紋圖譜,作為控制黃連藥材及葛根蘇連制劑的內(nèi)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

4.3 X射線衍射法(XRD) 當(dāng)某一物質(zhì)進(jìn)行衍射分析時,該物質(zhì)被X射線照射而產(chǎn)生不同程度的衍射現(xiàn)象。X慚萇渲肝仆計拙哂兄肝菩鄖,能立即知道樣品成分,圖譜穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)。劉小平等[15]通過對8份樣品的Fourier圖譜分析鑒定,獲得六味地黃丸的標(biāo)準(zhǔn)X采湎哐萇銯ourier指紋圖譜及特征標(biāo)記峰值,建立中藥六味地黃丸的新鑒定方法。

4.4 核磁共振波譜法(NMR) 核磁共振波譜是一種物理方法,它檢測的是組成有機(jī)化合物分子的原子核的性質(zhì)及其周圍化學(xué)環(huán)境的相互作用。在適當(dāng)?shù)拇艌鰲l件下,樣品能夠吸收射頻區(qū)的電磁輻射。所吸收的輻射頻率取決于樣品特性,吸收與分子中某一給定的原子核有關(guān),吸收峰頻率對吸收峰強(qiáng)度作圖構(gòu)成NMR譜圖。主要應(yīng)用領(lǐng)域是測定分子的結(jié)構(gòu)。

4.5 色譜聯(lián)用技術(shù) 色譜聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn)加快了中藥研發(fā)的步伐。目前正處于快步發(fā)展階段并廣泛應(yīng)用的色譜聯(lián)用技術(shù)包括氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(GC睲S)、液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC睲S)、液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC睲S睲S)、毛細(xì)管電泳/質(zhì)譜聯(lián)用(CE睲S)、電感耦合等離子體/質(zhì)譜聯(lián)用(ICP睲S)等。將色譜法良好的分離技術(shù)和波譜法特有的結(jié)構(gòu)鑒別能力相結(jié)合,已成為非常有效的分離鑒定手段。曹進(jìn)等[16]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對桂枝湯的A部分進(jìn)行了多維多息化學(xué)特征的指認(rèn),通過質(zhì)譜中質(zhì)荷比(m/z)值及HPLC的保留時間的相互對照,將桂枝湯A部分中的主要成分進(jìn)行歸屬。

5 中藥指紋圖譜未來的發(fā)展趨勢

目前中藥指紋圖譜的研究基本上反映的都是化學(xué)信息,而非藥效信息。存在指紋圖譜與藥效脫節(jié)的現(xiàn)象[17],也是指紋圖譜最有爭議的地方。指紋圖譜的變化必然引起藥理作用的變化。今后在中藥化學(xué)指紋圖譜、藥效物質(zhì)成分鑒定和中藥藥效活性測定的基礎(chǔ)上,充分利用現(xiàn)代化學(xué)與生物信息學(xué)研究的成果,開展指紋圖譜信息與藥效活性信息的相關(guān)性研究,使中藥指紋圖譜能較完整的表征中藥制劑復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)的大量信息的同時,也能夠表征各種藥理活性和藥效作用。

中藥指紋圖譜是中藥現(xiàn)代化關(guān)鍵問題之一。中藥指紋圖譜不僅是一種中藥質(zhì)量控制模式和技術(shù),也是一種進(jìn)行中藥理論研究和新藥開發(fā)的模式和技術(shù)。采用對照品對照或化合物鑒定,鑒定其主要特征指紋的化合物結(jié)構(gòu),以提高指紋圖譜的可信度,建立完整、詳細(xì)的圖譜庫,將成為未來指紋圖譜研究的重點(diǎn)及根本所在。

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