胡士斌

摘要RNAi作為廣泛存在于生物中的一種古老現(xiàn)象,是生物抵抗異常DNA的一種保護(hù)機(jī)制,在植物體內(nèi)充當(dāng)免疫系統(tǒng)的角色。就RNAi的作用機(jī)制及其在植物抗病毒方面的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞RNAi;植物免疫;作用機(jī)制;應(yīng)用

中圖分類號(hào)Q352文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)14-0354-01

RNAi是通過雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介導(dǎo)特異性地降解靶mRNA,使靶基因發(fā)生沉默;RNAi作為廣泛存在于生物中的一種古老現(xiàn)象,是生物抵抗異常DNA的一種保護(hù)機(jī)制。它可以識(shí)別外來DNA分子,使之沉默,并且穩(wěn)定和放大這種應(yīng)答,是植物體內(nèi)的免疫系統(tǒng),抵御著病毒等異常DNA的入侵。

1RNAi的發(fā)現(xiàn)

1990年Napoli等[1]向矮牽牛中導(dǎo)入多拷貝查爾酮合成酶基因以期產(chǎn)生顏色更深的紫色矮牽?；?結(jié)果許多花朵的顏色不但沒有加深,反而變成白色或花白色;他把這種奇怪的現(xiàn)象稱為“共抑制”。1995年,康乃爾大學(xué)的Guo和Kempheus[2]利用反義RNA(antisense RNA)技術(shù)特異性地阻斷線蟲(C. elegans)中的par-1基因的表達(dá)以期得到與對(duì)照組注射正義RNA(sen se RNA)相反的結(jié)果,但結(jié)果卻令他們費(fèi)解:二者同樣阻斷了par-1基因的表達(dá)途徑。直到1998年,Fire和Mello等[3]首次將正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲,結(jié)果表現(xiàn)出比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默(gene silencing)。將這種現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNA in terference,RNAi)。隨后,RNAi現(xiàn)象在真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、小鼠等大多數(shù)真核生物中廣泛地發(fā)現(xiàn)。

2RNAi的分子機(jī)制

RNA沉默是存在于生物中的一種古老現(xiàn)象,是生物抵抗異常DNA(病毒、轉(zhuǎn)座因子和某些高重復(fù)的基因組序列)的保護(hù)機(jī)制,同時(shí)在生物發(fā)育過程中扮演著基因表達(dá)調(diào)控的角色,它可以通過降解RNA、抑制翻譯或修飾染色體等方式發(fā)揮作用。RNAi的機(jī)制可能是細(xì)胞內(nèi)雙鏈RNA在酶的作用下,形成約22個(gè)堿基大小的小干擾RNA(small inte-rfering RNAs,siRNAs),siRNAs可進(jìn)一步摻入多組分核酸酶(multicomponent nuclease)并使其激活,從而精確降解與siRNAs序列相同的mRNA,完全抑制了該基因在細(xì)胞內(nèi)的翻譯和表達(dá)。RNAi機(jī)制過程中一種被稱為Dicer的酶首先被鑒定出來,它是RNase Ⅲ家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一種。Dicer 能將長(zhǎng)的雙鏈RNA切割降解為19～23個(gè)堿基長(zhǎng)的小分子干擾核糖核酸(siRNA)。這是一個(gè)依賴ATP的耗能過程,切割后的siRNA 3′具有2個(gè)核苷酸TT突出末端。然后siRNA結(jié)合到核糖核酸酶復(fù)合物上形成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)。該復(fù)合體依賴ATP釋能而解聚siRNA雙鏈成單鏈以激活RISC?；罨腞ISC通過由siRNA決定的堿基互補(bǔ)配對(duì)原理切割具有同源序列的基因轉(zhuǎn)錄體,最終導(dǎo)致基因沉默效應(yīng)(圖1)[4]。

解開siRNA的雙鏈后,反義RNA鏈能作為雙鏈RNA合成的一個(gè)引物,以mRNA為模板,在RISC中的RNA依賴RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerases,RdRPs,又稱作RDRs)的作用形成新的dsRNA,再次被Dicer 識(shí)別并切斷,形成新的siRNA再循環(huán)作用于另外的靶向mRNA。這種不斷放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA,使RNAi作用在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到迅速并有效地抑制mRNA翻譯形成蛋白質(zhì)或多肽,從而有效地抑制了靶向基因蛋白質(zhì)或多肽的合成[5]。

除上述轉(zhuǎn)錄后基因沉默外,還有轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默。反向重復(fù)的基因或轉(zhuǎn)基因,無論它們是緊密相連,還是被其他序列隔開,都可以進(jìn)行異位配對(duì),配對(duì)的DNA作為信號(hào)導(dǎo)致一系列反映,包括甲基化、異染色質(zhì)化[6]或RNA的降解,最終造成基因不能正常表達(dá)。通過抑制重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,RNAi引導(dǎo)異染色質(zhì)形成,阻礙有可能換位的成分和其他外源DNA整合到基因組[7],這是外源基因插入后生物體的一種自我保護(hù)。

3利用RNAi產(chǎn)生抗病毒植物

RNA干擾現(xiàn)象本身就是植物天然的病毒防御系統(tǒng)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將與病毒同源的dsDNA的hpRNA載體整合到植物基因組,表達(dá)后就會(huì)引起病毒基因組的特異性降解,阻止病毒的復(fù)制擴(kuò)散,獲得穩(wěn)定遺傳的抗病毒植物。1998年,Waterhouse等[8]利用馬鈴薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段構(gòu)建IRS載體進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化,獲得抗性植株。水稻黃斑病毒(RYMV)感染是非洲水稻的嚴(yán)重病害,它可使水稻植株出現(xiàn)黃斑、矮化、葉片變窄、抽穗少、籽粒不實(shí)等癥狀。Pinto YM等[9]將編碼該基因的一關(guān)鍵酶的基因轉(zhuǎn)入水稻,誘發(fā)該基因沉默,從而使植物具有黃斑病毒的抗性,從而育成了可抗非洲各地RYMV的水稻品種,且能穩(wěn)定遺傳3代。Wang等利用含有大麥黃矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus,BYDV)PAV株系的復(fù)制酶基因片斷構(gòu)建成可產(chǎn)生發(fā)夾式RNA結(jié)構(gòu)的載體,將該載體導(dǎo)入大麥得到強(qiáng)抗性植株并得到穩(wěn)定遺傳。

在植物體內(nèi),RNAi是一種防御機(jī)制,它可以針對(duì)RNA病毒和轉(zhuǎn)位子產(chǎn)生天然免疫反應(yīng);但阻礙宿主防御反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子已在植物病毒中發(fā)現(xiàn)。這些病毒表達(dá)阻礙因子,如dsRNA連接蛋白,可以干擾宿主細(xì)胞的RNA沉默機(jī)制。P19是病毒抑制物蛋白之一,它以同型二聚體形式識(shí)別siRNA雙鏈復(fù)合物并與之共結(jié)晶,從而阻斷RNAi。在植物中一些RNAi阻礙因子以RISC為靶向或限制系統(tǒng)沉默信號(hào)的傳播,從而抑制RNAi[10],這為理解植物免疫系統(tǒng)和抗病育種提供了新的思路。

4參考文獻(xiàn)

[1] NAPOLI C,LEMIEUX C,JORGENSEN R. Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans[J]. Plant Cell,1990(2):279-289.

[2] GUO S,KEMPHEUS K J. Par-I,a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos,encodes a putative Ser/ Thr kinase that is asymmet rically distributed[J]. Cell,1995(81):611-620.

[3] FIRE A,XU S,MONTGOMERY M K,et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J]. Nature,1998(391):806-811.

[4] TUSCHL T,ZAMOREP D,LEHMANN R,et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro[J].Genes Dev,1999,13(24):3191-3197.

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[9] PINTO Y M,KOK R A,BAULCOMBE D C. Resistance to rice yellow mott levirus(RYMV)in cult ivated African rice varieties containing RYMV transgenes[J]. Nature Biotechnology,1999(17):702-707.

[10] MEISTER G,TUSCHL T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA[J]. Nature,2004,431(7006):343-349.