白金麗　溫淑湘

摘要：目的：研究金釵石斛(Dendrobium nobile Lindl，)總生物堿和粗多糖對(duì)白內(nèi)障的抑制作用。方法：采用溶劑法分離提取金釵石斛總生物堿和粗多糖；DMEM低糖培養(yǎng)基體外培養(yǎng)ICR大鼠晶狀體，將晶狀體分為7個(gè)組，分別在培養(yǎng)后6、12、18、24h共4個(gè)時(shí)段于解剖顯微鏡下觀察并記錄晶狀體混濁度的改變；檢測(cè)晶狀體水溶性蛋白、谷胱甘N(GSH)的含量及總超氧化物歧化酶(T SOD)和丙二醛(MDA)的活性。結(jié)果：在培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)段，正常對(duì)照組晶狀體始終保持透明，各藥物組晶狀體混濁度與模型組相比明顯較輕(P<0.05)，而金釵石斛總生物堿和粗多糖均能減輕晶狀體混濁度，并能顯著升高晶狀體水溶性蛋白、GSH含量及T SOD活性，降低MDA的活性(均P<0.05)，其中石斛總生物堿高劑量組效果最佳。結(jié)論：金釵石斛總生物堿和粗多糖在體外均有一定的抗白內(nèi)障之效，而總生物堿的效果優(yōu)于粗多糖。

關(guān)鍵詞：金釵石斛；白內(nèi)障；氧化損傷；晶狀體

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007--2349(2009)09--0057--03

白內(nèi)障(cataract)是眼睛內(nèi)晶狀體發(fā)生混濁由透明變成不透明，阻礙光線進(jìn)入眼內(nèi)，從而影響了視力。初期混濁對(duì)視力影響不大，而后漸加重，明顯影響視力甚至失明。在世界范圍內(nèi)白內(nèi)障是致盲的首要病因，現(xiàn)在世界上大約有2千萬人是由于白內(nèi)障而致盲，另有1億白內(nèi)障患者需要手術(shù)恢復(fù)視力，在大多數(shù)的非洲和亞洲國(guó)家，白內(nèi)障至少占盲人的一半。據(jù)我國(guó)調(diào)查的結(jié)果，白內(nèi)障也是我國(guó)引起失明的最主要的眼病。當(dāng)前許多中藥研究都是從提高晶狀體抗氧化能力人手，利用抗氧化劑或抗氧化酶激活劑來消除或中和晶狀體中的氧化產(chǎn)物，阻止或逆轉(zhuǎn)晶狀體變渾濁，從而抑制或延緩白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。石斛是一種名貴中藥材，抗白內(nèi)障是其主治功效之一。已有研究證實(shí)，石斛水煎劑可通過改變晶狀體相關(guān)酶的活性而對(duì)D半乳糖性白內(nèi)障起到防治作用，石斛的乙酸乙酯提取物在體外還可抑制醛糖還原酶和過氧化脂質(zhì)(LPO)的產(chǎn)生，這些研究在一定程度上揭示了石斛抗白內(nèi)障的作用機(jī)理。然而，石斛化學(xué)成分復(fù)雜，其抗白內(nèi)障的具體有效成分是什么，至今仍未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)晶狀體，對(duì)金釵石斛(Dendrobium nobile Lindl，)的粗提物總生物堿(totalalkaloids)和粗多糖(polysaccharides)抗白內(nèi)障作用進(jìn)行了探討。

1材料和方法

1，1試驗(yàn)材料動(dòng)物SD清潔級(jí)大鼠，雌雄不限，4～5周齡，體重(80～120)g，共計(jì)20只。由昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供，合格證號(hào)：滇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證第2005035號(hào)。

藥材和試劑：金釵石斛由云南鴻翔藥業(yè)有限公司提供；DMEM低糖培養(yǎng)基(上海玉博生物科技有限公司)；胎牛血清(長(zhǎng)春西諾生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，上海貝基生物科技有限公司)；體積分?jǐn)?shù)30％過氧化氫(H₂O₂，浙江臨安化工二廠)；吡諾克辛鈉滴眼液(武漢五景藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)；070202)；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司)；谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

試劑配制改良碘化鉍鉀試劑：甲液：0.85g次硝酸鉍溶于10mL冰醋酸，加水40mL；乙液：8.g碘化鉀溶于20mL水中；將甲液與乙液等量混合后，取1mL與2mL醋酸混合，供生物堿的顯色用。Molish試劑：甲液：a萘酚1g，加75％乙醇至10mL；乙液：濃硫酸；作為多糖的檢測(cè)用。

儀器RⅡ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；SHZ IliA型循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司)；BSllOS型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；HI-98128型pH計(jì)(北京HANNA)SW CJ IF型超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；Galaxy s型C02培養(yǎng)箱(美國(guó)RS Biotech)；ST PT型解剖顯微鏡(日本OLYMPUS)；PRISMTMR型低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Labnet)；7200型分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)。

1，2試驗(yàn)方法1，2，1金釵石斛總生物堿和粗多糖的分離提取及檢識(shí)金釵石斛總生物堿和粗多糖的提取方法：干燥金釵石斛切碎打成粗粉，加入95％乙醇85℃回流提取(4.5h／次×3次)，合并提取液，減壓回收乙醇后得到石斛浸膏，加1mol／L HCL調(diào)節(jié)浸膏的pH為3，氯仿萃取3遍后，棄氯仿層，加濃氨水調(diào)母液pH＝11，再經(jīng)氯仿萃取3遍，將氯仿層合并，減壓濃縮，揮干氯仿后即得到總生物堿。將醇提后的藥渣曬干后加人20倍體積的水，100℃回流提取(3h／次×4次)，合并提取液，減壓濃縮后，加入95％乙醇，直至醇濃度為70％，置于冰箱內(nèi)，隔夜取出沉淀用無水乙醇和丙酮各洗滌3遍，再經(jīng)Sevag法除蛋白處理，冷凍干燥，得到粗多糖?？偵飰A的檢識(shí)參照文獻(xiàn)：取少量分離所得的總生物堿于試管內(nèi)，加入蒸餾水和少許二甲基亞砜(DMSO)將其充分溶解，滴在薄層板上，噴霧改良碘化鉍鉀試劑后，可見薄層板上在提取物溶液的點(diǎn)顯現(xiàn)出非常明顯的桔紅色斑點(diǎn)，由此證明提取物為生物堿。粗多糖的檢識(shí)參照文獻(xiàn)：取多糖水溶液1mL加入Molish試劑3滴，搖勻，傾斜試管，沿試管壁緩慢滴加1mL濃硫酸，靜置，可見在試液與濃硫酸交界面產(chǎn)生非常明顯的紫色環(huán)，證明提取物為多糖。1，2，2藥物配制用PBS分別將總生物堿和粗多糖配制成濃度為50mg／mL的溶液(生物堿加少許DMSO助溶)，0.22μm微孔濾膜過濾滅菌處理后—20℃保存待用。1，2，3晶狀體的培養(yǎng)及分組參照文獻(xiàn)：頸椎脫臼處死大鼠，用眼科剪、鑷迅速摘取雙眼眼球，以含800U／mL青霉素、800ug／mL鏈霉素的冷PBS液漂洗眼球后，投入含相同濃度雙抗液的PBS液中浸泡，轉(zhuǎn)人超凈臺(tái)。約10min后將大鼠眼球轉(zhuǎn)移至含500U／mL青霉素、50μg／mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，小心從眼球后極部剪開鞏膜，取出晶狀體，去除晶狀體表面的虹膜和玻璃體，晶狀體經(jīng)PBS液漂洗2遍后，再用DMEM液漂洗1遍，然后再放入已預(yù)熱的24孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔含1mL DMEM培養(yǎng)基(含20％胎牛血清、100μ／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素)，預(yù)培養(yǎng)5h(37.0℃、體積分?jǐn)?shù)5％COD后，剔除受損傷或已混濁的晶狀體。將35只未受損傷、透明的晶狀體按照隨機(jī)原則分7個(gè)組培養(yǎng)，每組5只。正常對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清)，模型組(正常組培養(yǎng)基+2mmol／L H₂O₂)，生物堿高、低劑量組(正常組培

養(yǎng)基中各加入2mmol／L的H₂O₂，同時(shí)分別添加4、2mg／mL生物堿)，多糖高、低劑量組(在正常組培養(yǎng)基中各加入2mmol／L的H202，同時(shí)分別添加4、2mg／mL粗多糖)，陽性對(duì)照組(正常組培養(yǎng)基+2mmoL／L的H20z+10％吡諾克辛鈉滴眼液)。上述各組培養(yǎng)基均含IOOU／mL青霉素及100μg／mL鏈霉素。1，2，4觀察并照相記錄晶狀體混濁度加藥培養(yǎng)后，每6h更換1次培養(yǎng)液以保持H₂O₂濃度不變。同時(shí)觀察并記錄各組晶狀體混濁度。離體培養(yǎng)晶狀體混濁度的分級(jí)方法參照文獻(xiàn)。1，2，5晶狀體水溶性蛋白GSH含量及SOD、MDA活性檢測(cè)晶狀體拍照后，用冷PBS液洗滌2遍，盡量洗凈培養(yǎng)液，再用濾紙吸干水分，稱質(zhì)量。按質(zhì)量與體積比為1:10的量加入冷PBS液，在冰浴上充分勻漿后倒入2mL離心管中，4℃、12000r／min離心20min，取上清即為晶狀體水溶性蛋白，采用Bradford法檢測(cè)定蛋白含量。取剩余上清，分別采用二硫代二硝基苯甲酸法檢測(cè)GSH含量，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定總超氧化物歧化酶(T SOD)活性，采用硫代巴比妥酸(thibabitu-ric acid，TBA)法檢測(cè)MDA活性，以上操作方法均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。1，2，6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2，1各組藥物對(duì)晶狀體混濁度的影響各時(shí)段晶狀體混濁度經(jīng)量化處理后，進(jìn)行t檢驗(yàn)，各個(gè)藥物添加組中，陽性對(duì)照組、生物堿高劑量組晶狀體混濁度較模型組顯著減輕(均P<0.05)；生物堿高、低劑量組及粗多糖高、低劑量組晶狀體混濁度與陽性對(duì)照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。將各組晶狀體混濁度與過氧化氫損傷的時(shí)間進(jìn)行相關(guān)性分析，其中生物堿高劑量組差異有顯著性意義(P<0.01)，其他各組差異也均有顯著性意義(P<0.05)，由此可見，隨H₂O₂作用時(shí)間的延長(zhǎng)，晶狀體混濁度逐漸加重。結(jié)果見表1。

2，2各組藥物對(duì)晶狀體水溶性蛋白、GSH含量及MDA、T—sOD活性的影響由表2可見，模型組與正常對(duì)照組比較，水溶性蛋白含量、GSH含量、T—SOD活性均顯著降低，MDA活性顯著升高(均P<0.05)，而陽性對(duì)照組、生物堿組、粗多糖組可顯著升高水溶性蛋白、GSH含量以及T—SOD活性，降低MDA活性，各給藥組與模型組比較，差異均有顯著性意義(P<0.05)。生物堿高劑量組水溶性蛋白含量顯著高于陽性對(duì)照組(P<0.05)，GSH含量除多糖低劑量組顯著低于陽性對(duì)照組外(P<0.05)，其他各實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組比較均無顯著性差異(P>0.05)；T—SOD活性除生物堿低劑量組和多糖低劑量組顯著低于陽性對(duì)照組外(P<0.05)，其他各組與陽性對(duì)照組比較均無顯著性差異(P>0.05)；MDA活性除生物堿高劑量組顯著低于陽性對(duì)照組(P<0.05)外，其他各組與陽性對(duì)照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。

3討論

晶狀體的氧化損傷是目前常用的白內(nèi)障研究模型，而H₂O₂是很好的氧化損傷誘導(dǎo)劑。體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)功能下降或氧化作用增強(qiáng)均可導(dǎo)致眼組織的損傷，誘發(fā)或促進(jìn)白內(nèi)障的形成。而活性氧簇，如H₂O₂、超氧陰離子、單態(tài)氧、氫氧根等可以引起很多生物學(xué)變化，最終使晶狀體的水不溶性蛋白增加而形成白內(nèi)障。GSH是一種抗氧化酶，在晶狀體中含量較高，對(duì)晶狀體起著多方面的重要作用。SOD和MDA常常相互配合用以反映組織細(xì)胞氧化／抗氧化系統(tǒng)功能的平衡。本研究采用體外構(gòu)建氧化損傷白內(nèi)障模型的方法，對(duì)金釵石斛總生物堿和粗多糖的抗白內(nèi)障作用進(jìn)行探討。結(jié)果顯示，模型組可溶性蛋白含量顯著低于正常對(duì)照組，而各用藥組可顯著緩解可溶性蛋白的減少，生物堿高劑量組尤其明顯；同時(shí)，金釵石斛的提取物總生物堿和粗多糖均可提高晶狀體GSH含量及SOD活性，同時(shí)降低MDA活性，即通過提高晶狀體抗氧化能力而達(dá)到抑制白內(nèi)障的作用。

金釵石斛能顯著提高SOD水平，降低LPO而起到抗白內(nèi)障的作用，但其抗白內(nèi)障的確切有效成分至今仍未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，金釵石斛的兩種藥效部位(總生物堿和粗多糖)在體外可通過減輕晶狀體的氧化損傷而抑制白內(nèi)障的進(jìn)程，且總生物堿的效果優(yōu)于粗多糖。然而，金釵石斛化學(xué)成分復(fù)雜，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其總生物堿含量達(dá)0.4％～0.6％，種類有30多種，多糖含量也高達(dá)4％，并以各種不同的形式存在，因此，下一步研究可從這兩種粗提物人手，進(jìn)一步挖掘金釵石斛抗白內(nèi)障的確切有效成分，并闡明其抗氧化的具體反應(yīng)過程，這對(duì)于抗白內(nèi)障的藥物研究以及金釵石斛藥用價(jià)值的開發(fā)都有著重要的意義。