張桂芝 武 彬 黃保華 劉雪蘭 石天虹 井慶川 劉雪蘭 魏祥法

摘 要:凝乳酶是一種酸性蛋白酶,用作動(dòng)物飼料添加劑,可提高動(dòng)物特別是幼齡動(dòng)物對(duì)飼料中蛋白成分的消化吸收率,促進(jìn)其生長(zhǎng)。本試驗(yàn)研究了由畢赤酵母胞外表達(dá)多拷微小毛霉凝乳酶的搖瓶發(fā)酵條件。確定最佳表達(dá)條件為:甲醇每24 h添加1.0%,無(wú)氨基酵母氮源培養(yǎng)基(YNB)添加1.5%,采用pH 6.0的磷酸緩沖液,誘導(dǎo)120 h,在此條件下,重組凝乳酶的產(chǎn)量可達(dá)6 500 IU/ml。

關(guān)鍵詞:凝乳酶;發(fā)酵條件;畢赤酵母

中圖分類(lèi)號(hào):S816.79 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2009)12-0081-04

凝乳酶(EC3.4.23.4)是一種酸性蛋白酶,能促進(jìn)蛋白質(zhì)凝結(jié),用作動(dòng)物飼料添加劑,可提高動(dòng)物特別是幼齡動(dòng)物對(duì)飼料中蛋白成分的消化吸收率,促進(jìn)其生長(zhǎng)[1]。幼齡動(dòng)物的消化系統(tǒng)發(fā)育還不完善,對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)的消化吸收率較低。提高飼料中蛋白類(lèi)的利用效率,不僅能夠節(jié)約飼料資源,降低養(yǎng)殖成本,而且能夠降低動(dòng)物糞便的氨氮排放,減輕集約化飼養(yǎng)對(duì)環(huán)境的污染[2]。

巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是一種比較理想的真核微生物表達(dá)系統(tǒng),是用于表達(dá)重組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)工具之一,近年發(fā)展和應(yīng)用較多[3]。Pichia pastoris具有與真核生物極其相似的分泌途徑和很強(qiáng)的真核蛋白質(zhì)修飾功能,其自身分泌的蛋白質(zhì)很少且易于高密度發(fā)酵,因此在表達(dá)和分離純化異源蛋白質(zhì)等方面具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。但巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)也會(huì)出現(xiàn)分泌蛋白聚合、降解等現(xiàn)象,從而降低蛋白的生物活性和產(chǎn)量[4]。此外,酵母細(xì)胞的生理狀態(tài)也會(huì)嚴(yán)重影響其產(chǎn)酶活性,培養(yǎng)基的pH和甲醇、無(wú)氨基酵母氮源培養(yǎng)基(YNB)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度,對(duì)細(xì)胞的代謝狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生很大影響。本研究室成功地將微小毛霉凝乳酶在畢赤酵母中表達(dá)[5]。本試驗(yàn)對(duì)重組凝乳酶發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值、甲醇和YNB濃度,以及接種比例等發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,提高了重組凝乳酶的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:具有12拷貝基因的整合重組畢赤酵母菌PIC9K-mcp-03。

培養(yǎng)基:BMGY/BMMY培養(yǎng)基:取酵母提取物10 g,蛋白胨20 g,溶于700 ml去離子水中,高壓滅菌20 min,冷卻至室溫,加入1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)100 ml、10×YNB 100 ml、500×B 2 ml、10×GY 100 ml(若制備BMMY,用100 ml 10×M代替10×GY),4℃保存?zhèn)溆?如無(wú)特殊說(shuō)明,均采用上述條件,改變其中某項(xiàng)發(fā)酵條件時(shí),其它項(xiàng)目不變)。1 000 ml三角瓶中加入100 ml培養(yǎng)基,于29℃ 170 r/min振蕩培養(yǎng)5 d,每24 h補(bǔ)加甲醇1次。

1.2 方法

1.2.1 甲醇和YNB添加量對(duì)發(fā)酵液的影響 改變BMMY培養(yǎng)基中甲醇(0～3%)和YNB(0～4%)的添加量,其它條件不變,培養(yǎng)120 h,測(cè)定發(fā)酵液OD600 nm和發(fā)酵上清液酶活力。

1.2.2 接種量對(duì)重組凝乳酶產(chǎn)量的影響 改變BMMY培養(yǎng)基的接種量,選擇不同體積的BMGY培養(yǎng)獲得的菌體細(xì)胞,加入BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h,測(cè)定發(fā)酵液OD600 nm和發(fā)酵上清液酶活力。

1.2.3 BMMY培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)重組凝乳酶產(chǎn)量的影響 改變BMMY培養(yǎng)基中所含磷酸緩沖液的pH值,分別調(diào)至pH 4.0～7.0,培養(yǎng)120 h,測(cè)定發(fā)酵液OD600 nm和發(fā)酵上清液酶活力。

1.2.4 菌體濃度的計(jì)算方法 將發(fā)酵液離心,菌體沉淀以蒸餾水重懸,經(jīng)適當(dāng)稀釋后,測(cè)定并計(jì)算菌體懸濁液在600 nm的OD值。

1.2.5 酶活測(cè)定采用Arima方法[7] 適當(dāng)稀釋的上清液0.5 ml 35℃保溫5 min,加入到35℃預(yù)保溫10 min的5 ml 10%脫脂牛乳中,計(jì)時(shí)至管壁出現(xiàn)顆粒。記錄凝乳時(shí)間(T)。酶活定義:在一定溫度下(35℃),40 min凝乳1 ml牛乳的酶量為一個(gè)酶活單位。

凝乳酶活力(U)=[(5×2400)/(0.5×T)]×n,其中:T為凝乳時(shí)間,n為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醇和YNB添加量對(duì)重組凝乳酶產(chǎn)量的影響

甲醇和YNB在培養(yǎng)基中起提供營(yíng)養(yǎng)的作用,甲醇除了是發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源,還是外源蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)物,其濃度對(duì)重組凝乳酶的表達(dá)有一定的影響,隨著甲醇濃度的增加重組凝乳酶的表達(dá)量也增加。而YNB除了作為培養(yǎng)基的氮源,還含有維生素和多種無(wú)機(jī)鹽類(lèi)。但二者在較高濃度下,又對(duì)發(fā)酵有抑制作用,且高濃度的甲醇對(duì)酵母菌也有毒害作用,甲醇經(jīng)代謝生成甲醛和甲酸,甲醛可與帶有羥基、巰基、氨基基團(tuán)的分子發(fā)生親核加成反應(yīng),向其提供亞甲基,使自由的分子鏈被甲醛交聯(lián)起來(lái),失去原有的生理功能,因此會(huì)影響重組凝乳酶的表達(dá)量。而YNB中含有的(NH₄)₂SO₄、K₃PO₄、和NaCl、CaCl₂等無(wú)機(jī)鹽在較高濃度下,同樣會(huì)影響畢赤酵母的生長(zhǎng)代謝,降低重組凝乳酶的表達(dá)量。培養(yǎng)基中YNB和甲醇的添加量對(duì)重組凝乳酶的影響如圖1所示。結(jié)果表明甲醇濃度在1%、YNB濃度為1.5%時(shí),畢赤酵母的生物量與重組凝乳酶的產(chǎn)量達(dá)到最高值。

2.2 接種量對(duì)重組凝乳酶產(chǎn)量的影響畢赤酵母的接種量實(shí)際上是有可能表達(dá)重組

凝乳酶的細(xì)胞數(shù),這些酵母是否表達(dá)目的蛋白,還受多種環(huán)境因素的影響。除了底物濃度之外,實(shí)際上培養(yǎng)基中的溶氧量具有重要的影響。圖2為接種量影響重組凝乳酶表達(dá)量的結(jié)果。隨接種量的增加,菌體生物量與酶活力的變化情況并不一致,酶活力在接種量為20%時(shí)達(dá)到最高值,25%也保持較高水平,之后略有下降;而菌體生物量在接種量為30%時(shí)達(dá)到最高,之后迅速下降。因此,溶氧量很可能是畢赤酵母表達(dá)的主要限制性因素。因?yàn)槿苎趿渴芏喾N因素影響,改變搖床的轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基成分等都會(huì)改變?nèi)苎鯘舛?并導(dǎo)致表達(dá)量的改變。因此,最佳接種量的測(cè)定會(huì)隨上述條件改變而略有波動(dòng),一般在16.7%～25.0%之間。

2.3 培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)重組凝乳酶產(chǎn)量的影響

改變培養(yǎng)基的pH值對(duì)細(xì)胞的活性也會(huì)產(chǎn)生很大影響。重組凝乳酶在pH 3.2～8.0都比較穩(wěn)定,因此發(fā)酵培養(yǎng)基可選的pH值范圍較廣。根據(jù)酵母的代謝特點(diǎn),測(cè)定了初始培養(yǎng)基在pH 4.0～7.0畢赤酵母的生物量和凝乳酶的表達(dá)量(圖3)。在發(fā)酵過(guò)程中酵母會(huì)產(chǎn)酸,因此改變了加入培養(yǎng)基的磷酸緩沖液的pH值。

酵母表達(dá)系統(tǒng)中外源蛋白的降解失活和不同pH值對(duì)酵母生理狀態(tài)的影響,是導(dǎo)致重組凝乳酶表達(dá)量的兩項(xiàng)主要因素。圖3的結(jié)果顯示,在pH 4.0～7.0范圍內(nèi),凝乳酶的活力與菌體濃度變化基本一致,推測(cè)可能是由于重組凝乳酶在不同pH值下穩(wěn)定性較強(qiáng),且凝乳酶自身作為蛋白酶具有較強(qiáng)的蛋白酶水解抗性。

3 討論與結(jié)論

發(fā)酵時(shí)間、營(yíng)養(yǎng)和誘導(dǎo)物的添加量、接種量以及培養(yǎng)基初始pH值對(duì)重組凝乳酶的產(chǎn)量都有顯著影響,但上述影響只是表觀現(xiàn)象。實(shí)際上,這些因素的影響更深入地體現(xiàn)在對(duì)酵母的生理狀態(tài)和重組凝乳酶的特定影響兩個(gè)方面。

甲醇作為發(fā)酵的誘導(dǎo)物和碳源,而YNB作為氮源,在一定濃度下對(duì)重組凝乳酶的表達(dá)具有促進(jìn)作用,但二者在較高濃度下,又對(duì)發(fā)酵有抑制作用。實(shí)際上不論是甲醇還是YNB對(duì)畢赤酵母生物量和表達(dá)量的影響并不一致。在低濃度下,甲醇主要表現(xiàn)誘導(dǎo)作用,而只表現(xiàn)出較弱的作為碳源的作用。因此,甲醇添加量為0.5%時(shí),盡管OD600nm表征的菌體量較低,卻獲得了較高的酶活力。而在添加量為0.5%時(shí),YNB作為氮源則主要表現(xiàn)出對(duì)菌體的促進(jìn)生長(zhǎng)作用,只有在滿足了菌體生長(zhǎng)需要后,在添加量為1.0%～1.5%時(shí),才表現(xiàn)出促進(jìn)重組蛋白分泌的作用。

接種量以及營(yíng)養(yǎng)物添加濃度導(dǎo)致重組凝乳酶產(chǎn)量的變化,從根本上講,體現(xiàn)的都是酵母生理狀態(tài)對(duì)重組蛋白分泌量的影響。OD600 nm所表征的菌體濃度與蛋白分泌量的差別正說(shuō)明了這一點(diǎn)。以甲醇為碳源,需要消耗大量的溶解氧,提高接種量,菌體濃度增加,勢(shì)必降低單位細(xì)胞可利用的溶解氧含量,從而降低單位細(xì)胞重組蛋白的表達(dá)量。

酸堿度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面:首先,發(fā)酵液初始pH值將影響酵母細(xì)胞的生理狀態(tài);其次,發(fā)酵液的pH值還對(duì)表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性有一定的影響。因?yàn)槟槊妇哂休^強(qiáng)的pH值穩(wěn)定性,而且該酶本身為真菌胞外蛋白酶,對(duì)其它蛋白酶的水解具有一定的抗性,所以,圖3顯示的培養(yǎng)基初始pH值對(duì)畢赤酵母生物量和表達(dá)量的影響比較一致,即本試驗(yàn)中,發(fā)酵液初始pH值影響重組凝乳酶表達(dá)量,主要是源于對(duì)酵母細(xì)胞生理狀態(tài)的影響。

上述各種因素對(duì)酵母細(xì)胞的生理狀態(tài)具有不同的影響機(jī)理,各種影響作用相互交叉、十分復(fù)雜,而正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求各個(gè)影響因素的作用彼此相互獨(dú)立。因此,本試驗(yàn)的各項(xiàng)影響因素不宜簡(jiǎn)單套用正交試驗(yàn)進(jìn)行最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化,而試驗(yàn)中獲得的發(fā)酵條件還有進(jìn)一步優(yōu)化的空間。

參 考 文 獻(xiàn):

[1] 肖 競(jìng),孫建議,李衛(wèi)芬.酸性蛋白酶及其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用[J].飼料博覽, 2003, 3:27-29.

[2] 費(fèi)笛波,錢(qián)玉英,葉玲玲,等. 黑曲霉菌株6042飼用酸性蛋白酶的性質(zhì)及其應(yīng)用研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1997, 9(6):300-304.

[3] Hao Y Y, Chu J,Wang Y H,et a1.Expression and aggregation of recombinatant human consensus interferon-α mutant by Pichia pastoris[J]. Biotechnology Letters, 2006, 28(12):905-909.

[4] Macauley-Patrick S,Fazenda M L,McNeil B,et a1.Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system[J].Yeast, 2005, 22: 249-270.

[5] 張桂芝,武 彬,井慶川, 等.微小毛酶凝乳酶的基因克隆及在畢赤酵母GS115中的表達(dá)[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,11:1-4.