李利斌 劉開昌 李現(xiàn)剛

摘 要:利用比較基因組學(xué)的方法從玉米的基因組中鑒定出三個新的SnRK2基因,并對這三個基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、蛋白基序、遺傳進化以及上游順式調(diào)控元件進行了分析,為進一步研究它們在玉米逆境應(yīng)答中的功能和利用它們進行玉米分子育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:玉米;SnRK2基因;比較基因組學(xué);特征分析

中圖分類號:Q785 文獻標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2009)12-0007-05

植物在生長發(fā)育過程中經(jīng)常遇到不良的環(huán)境條件如干旱、鹽脅迫、低溫或高溫的影響。為了生存,植物進化出復(fù)雜的生理和遺傳機制來感受外部刺激并對逆境做出響應(yīng)[24]。闡明植物逆境脅迫的抗性機制和提高作物在各種脅迫條件下的抗性水平是各國科學(xué)家研究的主要目標(biāo)。已有研究表明,植物SNF1相關(guān)蛋白激酶家族基因參與了植物的多種逆境響應(yīng)和生長發(fā)育過程[2～4,6,7,9,14,21,23,25]。根據(jù)核酸和蛋白序列相似性,植物中的SNF1相關(guān)蛋白激酶基因分為三個家族:SnRK1、SnRK2和SnRK3[12]。其中,SnRK1和動物中AMPK基因同源,主要參與碳代謝和能量代謝;SnRK2和SnRK3為植物特有,主要參與對環(huán)境因素如干旱和鹽脅迫等的應(yīng)答過程。越來越多的研究表明,SnRK2家族基因在植物脫落酸(Abscisic acid, ABA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、滲透脅迫響應(yīng)、氣孔開閉、礦質(zhì)營養(yǎng)吸收以及生長發(fā)育過程中具有重要作用。例如,擬南芥AtSnRK2.6/OST1可以和ABI(ABA不敏感型突變體)互作來整合ABA和滲透脅迫的信號,正向調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉[1,19,26]。最近研究發(fā)現(xiàn)AtOST1在擬南芥中對于防止細(xì)菌從氣孔的入侵是必需的[18]。對AtSnRK2.10的研究顯示,它能夠磷酸化擬南芥和水稻中的脫水素蛋白,而且可以和磷脂酸結(jié)合調(diào)控逆境反應(yīng)[22]。而AtSnRK2.8/AtSnRK2C與代謝有關(guān),而且在缺鉀條件下下調(diào)表達,植株生長明顯下降,而過量表達AtSnRK2.8可顯著增強擬南芥植株在干旱脅迫下的抗性和生長[18,20]。衣藻的SnRK2.1和擬南芥的AtSnRK2.3在調(diào)節(jié)硫饑餓條件下的基因表達和代謝反應(yīng)起到重要作用[11,13],而且AtSnRK2.2和AtSnRK2.3在種子萌發(fā)、根系生長及幼苗生長過程中ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要功能[7]。而AtSnRK2.9在缺磷條件下誘導(dǎo)表達,突變體研究表明AtSnRK2.9對擬南芥生物量和種子產(chǎn)量形成具有重要作用[10]。蠶豆的AAPK基因可以通過磷酸化RNA結(jié)合蛋白AIPK1來調(diào)節(jié)脫水素基因的表達和逆境響應(yīng)[16,17]。麥類的PKABA1與 ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[11],小麥的W55a參與多種逆境應(yīng)答[23]。研究還發(fā)現(xiàn),SnRK2家族不同成員對ABA和滲透脅迫的響應(yīng)有所不同,它們在脅迫條件下可以被磷酸化和激活,并優(yōu)先磷酸化bZIP類的轉(zhuǎn)錄激活子,如擬南芥中的AREB1和水稻的TRAB1/ABFs,從而調(diào)節(jié)它們的活性和下游基因的表達[5, 8,15]。另外,活化的SnRK2蛋白可以自身磷酸化,而且在ABA和滲透脅迫條件下SnRK2被磷酸化的機制有所不同[4,14]。

玉米是目前世界上第一大作物,我國第二大作物。人們圍繞玉米的抗旱生理和遺傳機制及品種抗旱性改良做了大量的研究工作。盡管SnRK2基因在植物滲透脅迫反應(yīng)和ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要功能,但關(guān)于玉米SnRK2基因的研究很不充分[27,28]。通過生物信息學(xué)分析,本試驗鑒定出三個新的玉米SnRK2基因,對它們的基因結(jié)構(gòu)、蛋白基序、啟動子區(qū)的順式作用元件進行了預(yù)測和分析,并對它們與擬南芥和水稻的SnRK2基因進行了系統(tǒng)進化分析,為進一步研究這些基因在玉米中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

用已克隆的水稻SnRK2基因序列搜索各類公共數(shù)據(jù)庫,尋找玉米的SnRK2序列,通過NCBIblastX進行序列比對和在MaizeGDB中進行EST搜索比對,確定玉米SnRK2基因及其編碼序列。利用Mega 4.1對這些基因及擬南芥和水稻的SnRK2基因進行系統(tǒng)進化分析,擬南芥和水稻的SnRK2基因序列號見參考文獻[14]。利用PlantsP Feature Scan對玉米SnRK2基因編碼的蛋白進行結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析。利用Maizesequence中的結(jié)果和SnRK2基因所在玉米基因組克隆BAC的信息對它們進行染色體定位。通過SnRK2編碼區(qū)和基因組序列的比對來顯示基因外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)組成。根據(jù)編碼區(qū)序列和其所在BAC的序列得到各個SnRK2基因起始密碼子ATG上游2 000 bp的啟動子區(qū)及上游序列。利用PLANTCARE對啟動子區(qū)的順式反應(yīng)元件進行預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米SnRK2新基因的鑒定和特征分析

通過獨立的序列搜索和分析,作者在玉米基因組中找到三個SnRK2基因,分別位于基因組克隆AC207670、AC197912和AC214763中。根據(jù)它們所在基因組克隆的定位信息,確認(rèn)這三個基因為新的SnRK2基因,與王國英研究組報道的11個玉米SnRK2基因和鄒華文等報道的ZmSPK1不同[27,28]。序列分析發(fā)現(xiàn)ZmSPK1與王國英研究組報道的ZmSnRK2.6一致。為統(tǒng)一起見,作者將這三個新基因分別命名為ZmSnRK2.12、ZmSnRK2.13和ZmSnRK2.14。它們在染色體上的分布和序列結(jié)構(gòu)特征見表1和圖1。這三個基因分別位于玉米的5號或4號染色體上,分別含有5個或8個內(nèi)含子。序列分析發(fā)現(xiàn)在ZmSnRK2.14的第六和第七個外顯子之間存在一個8 460 bp的內(nèi)含子,這個內(nèi)含子包含一個5 000 bp左右與水稻的多聚蛋白類似的轉(zhuǎn)座子序列。在GenBank中, 它們都有相應(yīng)的cDNA序列,說明這些基因都是可表達的基因。

蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)(見表2),玉米的這三個基因預(yù)測編碼的蛋白都含有激酶結(jié)構(gòu)域、ATP-結(jié)合區(qū)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點和三個潛在的豆蔻?；稽c。另外,ZmSnRK2.12和ZmSnRK2.13具有天冬氨酸富含區(qū),而ZmSnRK2.12還具有一個跨膜結(jié)構(gòu)域。這說明三個新的玉米SnRK2蛋白具有ser/thr蛋白激酶的結(jié)構(gòu)特征,可能被豆蔻?；揎椪{(diào)節(jié)。

2.2 玉米SnRK2新基因的序列比對和系統(tǒng)進化分析

將三個玉米SnRK2新基因與水稻、擬南芥的SnRK2基因進行了系統(tǒng)進化分析和序列比對。結(jié)果(圖2、3)表明,ZmSnRK2.12/OsSAPK10、ZmSnRK2.13/OsSAPK8、ZmSnRK2.14/OsSAPK6可能為直系同源基因,它們編碼的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的序列一致性分別為96.50%、94.19%、98.05%。已有研究表明,OsSAPK6可通過磷酸化ABF類轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)對ABA的應(yīng)答[5],而OsSAPK8和OsSAPK10的表達受ABA和滲透脅迫調(diào)節(jié),而且可被磷酸化調(diào)節(jié)[14]。另外,三個玉米SnRK2新基因與擬南芥SnRK2的進化分析表明,ZmSnRK2.12/AtSnRK2.6、ZmSnRK2.13/AtSnRK2.6、ZmSnRK2.14/AtSnRK2.4、ZmSnRK2.14/AtSnRK2.10可能為直系同源基因, 它們編碼的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的序列一致性分別為91.83%、 90.70%、 87.94%、 86.77%。AtSnRK2.6在調(diào)節(jié)氣孔運動和ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要功能,而且能夠通過磷酸化ABF類轉(zhuǎn)錄因子來行使功能[1,19,26],防止細(xì)菌從氣孔入侵?jǐn)M南芥[18]。對AtSnRK2.10的研究顯示,它能夠磷酸化擬南芥中的脫水素蛋白,還可與磷脂酸結(jié)合調(diào)控脅迫應(yīng)答反應(yīng)[22]。根據(jù)進化分析和水稻、擬南芥SnRK2基因功能研究的結(jié)果,推測玉米的SnRK2.12具有與AtSnRK2.6和OsSAPK10類似的功能,SnRK2.13與AtSnRK2.6和OsSAPK8的功能相似,而SnRK2.14與OsSAPK6和擬南芥的AtSnRK2.4/AtSnRK2.10功能相似。

2.3 玉米SnRK2新基因的順式反應(yīng)元件預(yù)測

高等植物基因的表達主要是順式反應(yīng)元件和反式作用因子相互作用的結(jié)果。分析基因啟動子序列中順式反應(yīng)元件的類型可以為研究基因的功能提供一定線索。本研究在得到三個玉米新基因的基因組序列后,對起始密碼子ATG上游2 000 bp序列所包含的順式元件進行了預(yù)測分析。 結(jié)果(表3)表明, 3個玉米SnRK2新基因啟動子區(qū)存在多個不同逆境和激素應(yīng)答順式作用元件: SnRK2.12擁有脫落酸應(yīng)答元件ABRE和Motif-IIb、脫水應(yīng)答元件DRE、熱脅迫應(yīng)答元件HSE、茉莉酸甲酯(MeJA)應(yīng)答元件CGTCA-motif、赤霉素(GA)應(yīng)答元件GARE-motif、生長素應(yīng)答元件TGA-element和TGA-box、生物鐘應(yīng)答元件以及病原物和逆境應(yīng)答元件W-box; SnRK2.13擁有脫落酸應(yīng)答元件ABRE、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件、低溫應(yīng)答元件、生長素應(yīng)答元件、生物鐘應(yīng)答元件、赤霉素應(yīng)答元件P-box、水楊酸應(yīng)答元件; 而SnRK2.14的順式元件較少,僅存在茉莉酸甲酯應(yīng)答元件、生物鐘應(yīng)答元件、水楊酸應(yīng)答元件、干旱應(yīng)答元件MBS和生物鐘應(yīng)答元件。這說明三個玉米SnRK2新基因可能參與多種逆境和激素信號的應(yīng)答,在植物逆境響應(yīng)過程中具有重要功能,值得深入探討。

3 小結(jié)

本研究利用比較基因組學(xué)的方法,從玉米基因組中鑒定出三個新的SnRK2基因。序列相關(guān)信息分析表明,它們不同于以前報道的玉米SnRK2基因。這樣在玉米的基因組中至少存在14個SnRK2基因,而在水稻的基因組中目前確認(rèn)有10個SnRK2基因。這可能與玉米擁有較大的基因組有關(guān)。進化和順式元件分析表明, 這三個新的玉米SnRK2基因可能在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境應(yīng)答過程中具有重要功能。它們的表達調(diào)控、在基因網(wǎng)絡(luò)中的位置和功能,以及在玉米抗逆分子育種中的應(yīng)用值得進一步研究。

參 考 文 獻:

[1] Belin C, Franco P, Bourbouss C, et al. Identification of features regulating OST1 kinase activity and OST1 function in guard cells[J]. Plant Physiology, 2006, 141:1316-1327.

[2] Boudsocq M,Laurière C. Osmotic signaling in plants. Multiple pathways mediated by emerging kinase families[J]. Plant Physiology, 2005,138: 1185-1194.

[3] Boudsocq M, Barbier-Brygoo H, Laurière C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 ctivated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana[J]. J. Biol.Chem., 2004, 279: 41758-41766.

[4] Boudsocq M, Droillard M, Barbier-Brygoo H,et al.Different phosphorylation mechanisms are involved in the activation of sucrose non-fermenting 1 related protein kinases 2 by osmotic stresses and abscisic acid[J]. Plant Mol. Biol.,2007,63: 491-503.

[5] Chae M J, Lee J, Nam N, et al. A rice dehydration-inducible SNF1-related 2 phosphorylates an abscisic acid responsive factor and associates with ABA signaling[J].Plant Mol. Biol.,2007,63:151-169.

[6] Diédhiou C J, Popova O V, Dietz K,et al. The SNF1-type serine/threonine protein kinase SAPK4 regulates stress-responsive gene expression in rice[J]. BMC Plant Biology, 2008, 8: 49-61.

[7] Fujii H, Verslues P E,Zhu J K. Identification of two protein kinases required for abscisic acid regulation of seed germination, root growth, and gene expression in Arabidopsis[J].The Plant Cell, 2007, 19: 485-494.

[8] Furihata T, Maruyama K, Fujita Y, et al. Abscisic acid-dependent multisite phosphorylation regulates the activity of a transcription activator AREB1[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103: 1988-1993.

[9] Gonzalez-Ballester D, Pollock S, Pootakham W,et al. The central role of a SNRK2 kinase in sulfur deprivation responses[J]. Plant Physiology,2008, 147(1): 216-227.

[10]Hétu M F. Effect of nutritional status on phenotypic characteristics of Arabidopsis and alfalfa in relation to the expression of AtSnRK2.9[D].Canada:Queen's University,2007.

[11]Holappa L D, Walker-Simmons M K, Ho T H D,et al. A Triticum tauschii protein kinase related to wheat PKABA1 is associated with ABA signaling and is distributed between the nucleus and cytosol[J]. Journal of Cereal Science, 2005, 41:333-346. [12]Hrabak E M, Chan C W, Gribskov M,et al. The Arabidopsis CDPK-SnRK superfamily of protein kinases[J].Plant Physiol., 2003, 132: 666-680.

[13]Kimura T, Shibagaki N, Ohkama-Ohtsu N,et al. Arabidopsis SNRK2.3 protein kinase is involved in the regulation of sulfur-responsive gene expression and O-acetyl-l-serine accumulation under limited sulfur supply[J]. Soil Science & Plant Nutrition, 2006, 52 (2) : 211-220.

[14]Kobayashi Y, Yamamoto S, Minami H,et al. Differential activation of rice sucrose nonfermenting 1-related protein kinase2 family by hyperosmotic stress and abscisic acid[J]. Plant Cell, 2004, 16:1163-1177.

[15]Kobayashi Y, Murata M, Minami H,et al. Abscisic acid-activated SNRK2 protein kinases function in the gene-regulation pathway of ABA signal transduction by phosphorylating ABA response element-binding factors[J]. Plant J., 2005, 44: 939-949.

[16]Li J, Wang X Q, Watson M B,et al. Regulation of abscisic acid-induced stomatal closure and anion channels by guard cell AAPK kinase[J]. Science, 2000, 287: 300-303.

[17]Li J, Kinoshita T, Pandey S, et al. Modulation of an RNA-binding protein by abscisic-acid-activated protein kinase[J]. Nature, 2002, 418: 793-797.

[18]Melotto M, Underwood W, Koczan J,et al. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion[J]. Cell, 2006, 126(5): 969- 980.

[19]Mustilli A C, Merlot S, Vavasseur A,et al. Arabidopsis OST1 protein kinase mediates the regulation of stomatal aperture by abscisic acid and acts upstream of reactive oxygen species production[J]. Plant Cell, 2002, 14: 3089-3099.

[20]Shin R, Alvarez S, Burch A Y,et al. Phosphoproteomic identification of targets of the Arabidopsis sucrose nonfermenting-like kinase SnRK2.8 reveals a connection to metabolic processe[J]. PNAS,2007, 104(15): 6460-6465.

[21]UmezawaT, Yoshida R, Maruyama M,et al. SRK2C, a SNF1-related protein kinase 2, improves drought tolerance by controlling stress-responsive gene expression in Arabidopsis thaliana[J]. PNAS,2004, 101(49): 17306-17311.

[22]Vlad F, Turk B , Peynot P,et al. A versatile strategy to define the phosphorylation preferences of plant protein kinases and screen for putative substrates[J]. Plant Journal,2008, 55(1):104-117.

[23]Xu Z S, Liu L, Ni Z Y,et al. W55a encodes a novel protein kinase that is involved in multiple stress responses[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2009, 51(1): 58-66.

[24]Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses[J]. Annu. Rev. Plant Biol.,2006, 57: 781-803.

[25]Yoshida R, Hobo T, Ichimura K,et al. ABA-activated SnRK2 protein kinase is required for dehydration stress signaling in Arabidopsis[J]. Plant Cell Physiol.,2002, 43: 1473-1483.

[26]Yoshida R, Umezawa T, Mizoguchi T,et al. The regulatory domain of SRK2E/OST1/SnRK2.6 interacts with ABI1 and integrates abscisic acid (ABA) and osmotic stress signals controlling stomatal closure in Arabidopsis[J]. J. Biol. Chem., 2006, 281: 5310-5318.

[27]Zou H, Zhang X, Zhao J R,et al. Cloning and characterization of maize ZmSPK1,a homologue to nonfermenting1-related protein kinase2[J]. African Journal of Biotechnology, 2006, 5(6): 490-496.

[28]Huai J, Wang M, He J,et al. Cloning and characterization of the SnRK2 gene family from Zea mays[J]. Plant Cell Report, 2008, 27: 1861-1868.