李寶國　杜　雪　張孝衛(wèi)

[摘要] 目的:研究水牛角酶解的最佳提取工藝。方法:以蛋白質含量為指標,通過正交實驗篩選水牛角的最佳酶解提取條件。結果:水牛角最佳酶解工藝為:胃蛋白酶,pH=2,加酶量700 U/g,溫度39℃,時間4 h。結論:正交實驗確定的條件可較好地應用于水牛角的酶解提取。

[關鍵詞] 正交實驗;水牛角;酶解;提取工藝

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼]A [文章編號]1674-4721(2009)07(b)-024-02

水牛角始載于《名醫(yī)別錄》,為牛科動物水牛BubalusbubalisLinnaeus的角,為臨床常用中藥,性寒,味苦,具有清熱解毒、涼血、定驚的功效,用于溫病高熱、神昏譫語、發(fā)斑發(fā)疹、吐血衄血、驚風、癲狂等癥[1]。文獻資料表明對水牛角的活性物質及藥理活性研究較少,原藥材直接口服,生物利用度低,我們模擬人體胃腸道環(huán)境,采用生物酶仿生提取技術,以正交實驗篩選水牛角粉的提取工藝,為進一步研究奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 儀器與設備

電子天平;恒溫水浴鍋;H198107筆式酸度計;UV-120-02分光光度計;NO1506-017紫外分光光度掃描儀。

1.2 試劑與材料

水牛角粉(成都千方中藥飲片有限公司,國藥準字Z51022471);胃蛋白酶(活性1∶4600,濟南亞康力諾生物工程有限公司,批號070323);牛血清白蛋白(Roche公司);考馬斯亮藍G250(上海化學試劑站分裝廠,批號061005)。

2 實驗方法與結果

2.1檢測方法的建立

2.1.1 考馬斯亮藍試劑的配制

精密稱取考馬斯亮藍G 250 10 mg于100 ml容量瓶中,加5.00 ml乙醇使溶解,再加85%磷酸溶液10 ml,蒸餾水定容至刻度[2]。

2.1.2標準蛋白質溶液的制備

精密稱取25 mg牛血清白蛋白置于25 ml的容量瓶中,定容至刻度,配成1 000 μg/ml的標準蛋白質溶液。

2.1.3 樣品液的制備

稱取水牛角粉1.00 g,加入胃蛋白酶0.55 g,9.00 ml蒸餾水中,濃鹽酸調pH=(2.00±0.01),在(37.0±0.1)℃水浴中提取4 h。提取液放入85℃的水浴中滅活15 min后用濾紙過濾,得濾液,稀釋10倍,以12 000 r/min離心10 min,取上清液作為樣品液[3]。

2.1.4陰性樣品液的制備

按照2.1.3項下,無水牛角粉,同法制備陰性樣品液。

2.1.5 測量波長的確定

分別精密取蒸餾水、牛血清白蛋白標準液、樣品液、陰性樣品液各1.00 ml,依次加入5.00 ml考馬斯亮藍試劑,在200～700 nm范圍內進行全波長掃描。結果表明,牛血清白蛋白標準液、樣品液在波長為595 nm都有最大吸收,陰性樣品液干擾較小,選擇595 nm為測量波長。

2.1.6 線性關系的考察

分別制備不同濃度的牛血清白蛋白標準液,加入考馬斯亮藍試劑,在595 nm測吸光度,以A 595 nm為縱坐標,標準蛋白含量為橫坐標,繪制標準曲線,回歸方程為Y=0.010 97X-0.070 89,r=0.999 8,線性范圍為20～100 μg/ml。

2.2 正交實驗

2.2.1正交試驗因素水平

參考文獻[4-5],根據(jù)單因素實驗結果,選擇胃蛋白酶、9倍水,確定正交實驗因素水平,以L9(34)進行實驗。2.2.2 正交試驗方法與結果

方法:取水牛角粉1.00 g,加入胃蛋白酶,蒸餾水9.00 ml,鹽酸調pH值,水浴提取。提取液85℃滅活15 min,濾過,稀釋濾液,12 000 r/min離心,上清液作為樣品液。取樣品液,加入考馬斯亮藍試劑,595 nm測吸光度,經分析,酶解最佳條件為A2B2C2D2,即:加酶量700 U/g、溫度39℃、pH=2、時間4 h。。

2.3工藝驗證實驗

用A2B2C2D2條件進行3次工藝驗證,RSD=1.61%,結果表明酶解提取工藝良好。

3 討論

實驗結果表明,水牛角最佳酶解提取工藝為:胃蛋白酶、9倍水、700 U/g、39℃、pH=2、時間4 h。酶的特點是催化效率高,專一性強,作用條件溫和。蛋白酶能使蛋白質水解成肽和氨基酸,提高和改善蛋白質的溶解性、乳化性、起泡性、黏度等。生物酶仿生提取能避免酸法水解和堿法水解對蛋白類物質的破壞和變旋作用,有利于防止活性成分失活損失,確保臨床療效。中藥材直接口服,一般生物利用度低,浪費原料。本研究模擬人體胃腸道環(huán)境,采用生物酶仿生提取水牛角活性物質,利于防止活性成分失活損失,建立了一種用于水牛角酶解物的檢測方法,為進一步研究奠定了基礎,同時也為動物類藥材活性物質的提取分離提供了一種新的思路和方法學借鑒。

[參考文獻]

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京:化學工業(yè)出版社,2005:56-57.

[2]路蘋,于同泉,王淑英,等.蛋白質測定方法評價[J].北京農學院學報,2006,21(2):65-69.

[3]劉芳,王遂.酶法提取變性脫脂豆粕中蛋白質的研究[J].食品科學,2004,25(3):89-92.

[4]林超,王玉蓉,吳清,等.全蝎的酶解工藝研究[J].中藥制劑,2005,28(6):66-69.

[5]李津明.酶法水解林蛙油蛋白質的工藝研究[J].中國中藥雜志,2005,30(6):430-432.

(收稿日期:2009-04-13)