摘要：目的用單體型相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析(HHRR)和連鎖不平衡檢驗(yàn)(TDT)方法在冠心病(CHD)血瘀證家系中探討血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因內(nèi)含子16中的插入/缺失(I/D)多態(tài)是否為冠心病血瘀證的遺傳易患因素。方法2003年10月－2005年11月收集先征一級(jí)親屬中至少有1例冠心病病人的家系40個(gè)和健康人家系10個(gè)，屬CHD血瘀證家系組25個(gè)家系81例，其中核心家系18個(gè)共60例。PCR－RFLP方法鑒ACE基因I/D多態(tài)性基因座基因型。在對(duì)ACE基因多態(tài)與冠心病血瘀證基因存在關(guān)聯(lián)的基礎(chǔ)上進(jìn)行HEIRR和TUF分析。結(jié)果CHD家系A(chǔ)CE基因的基因型、等位基因都沒(méi)有偏離Hardy－Wemberg平衡。在HHRR中，ACE的D基因與冠心病血瘀證無(wú)關(guān)聯(lián)(P＞0 05)；對(duì)15個(gè)滿足要求的核心家系進(jìn)行T13T檢驗(yàn)，雜合子父母?jìng)鬟f給患病子代的D等位基因頻率未顯著偏離50％(P＞0.05)。結(jié)論在冠心病血瘀證家系中未發(fā)現(xiàn)ACE基因I/D多態(tài)與冠心病血瘀證存在關(guān)聯(lián)或與疾病基因座存在連鎖，說(shuō)明該基因座可能不是湖南漢族人群冠心病血瘀證的遺傳易惠基因，而是冠心病血瘀證的發(fā)病危險(xiǎn)因素之一。

關(guān)鍵詞：湖南漢族人群；冠心?。谎鲎C；遺傳易患性；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因；多態(tài)性

中圖分類號(hào)：R541.4 R256.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672－1349(2007)09－0787－03

冠心病(CHD)是一種多因素疾病，受環(huán)境和遺傳等多因素的影響，為有明顯遺傳傾向的多基因病。CHD的發(fā)生與發(fā)展與多種易患基因多態(tài)性有關(guān)，尤其與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)插入/缺失(I/D)基因多態(tài)性等密切相關(guān)。中醫(yī)理論認(rèn)為冠心病基本病機(jī)為心脈瘀阻，血瘀證是CHD最常見(jiàn)的證型，那么ACE基因多態(tài)性是否為CHD血瘀證家系的遺傳分子生物學(xué)標(biāo)志之一，值得深入研究。本研究就是在前期對(duì)ACE基因多態(tài)與冠心病基因存在群體關(guān)聯(lián)的研究基礎(chǔ)，利用核心家系資料進(jìn)行單體型相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析(HHRR)和連鎖不平衡檢驗(yàn)(TDT)分析，檢驗(yàn)該基因座是否與中國(guó)湖南漢族人群冠心病血瘀證基因存在連鎖。

1 資料與方法

1．1 研究對(duì)象2003年10月－2005年11月對(duì)長(zhǎng)沙地區(qū)冠心病中醫(yī)證候臨床流行病學(xué)研究中符合WHO冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)的3116例冠心病病人，篩查冠心病家族史，對(duì)其中521例存活且愿意接受調(diào)查者進(jìn)一步開(kāi)展遺傳流行病學(xué)調(diào)查。冠心病血瘀證家系定義為．先證者為CHD血瘀證病人，其一級(jí)親屬(父母、同胞及子代)至少有1人為冠心病血瘀證病人。共收集先證者一級(jí)親屬中至少有1例冠心病血瘀證病人的家系40個(gè)和健康人家系10個(gè)，屬cHD血瘀證家系組25個(gè)家系81例，其中核心家系18個(gè)共60例。屬非CHD血瘀證家系組15個(gè)家系共50例，其中核心家系10個(gè)共32例。兩組核心家系共28個(gè)。

以符合1979年WHO制定的缺血性心臟病心絞痛、心肌梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)，以病人臨床癥狀、體征和病史，結(jié)合心電圖改變進(jìn)行診斷。參照WHO多國(guó)心血管趨勢(shì)和決定因素監(jiān)測(cè)(MONIA)研究方案設(shè)計(jì)冠心病調(diào)查表，詳細(xì)記錄每一病例的臨床表現(xiàn)、輔助檢查、生化結(jié)果及危險(xiǎn)因素。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法采血前禁食12 h，于08:00空腹靜脈取血2 mL，以2％EDTANa抗凝。參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行基因組DNA提取，PCR－RELP方法鑒定DNA基因型。引物：由上海生工合成。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，基因型、基因分布頻率比較采用X²檢驗(yàn)，在核心家系中有關(guān)等位基因與疾病的遺傳關(guān)聯(lián)分析采用單體型相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)及傳遞不平衡檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，用X²檢驗(yàn)各率的分布差異。

1．3．1 HHRR統(tǒng)計(jì)核心家系中父母及子(女)的等位基因頻率獲得四格表，X²=2N(WZ-Xy)²/(W+X)(W+y)(X+Z)(y+Z)查表得出P，檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則有關(guān)聯(lián)，反之則無(wú)。

1．3．2 傳遞不平衡檢驗(yàn)(TDT)TDT＝(b-c)²/(b+c)；此統(tǒng)計(jì)量近似符合自由度為1的X²分布。以b表示含有關(guān)聯(lián)等位的雜合子型親代傳遞該等位的例數(shù)，以c表示雜合子親代未傳遞該關(guān)聯(lián)等位的例數(shù)，用配對(duì)四格表McNemar檢驗(yàn)作出獨(dú)立性判斷。

2 結(jié) 果

經(jīng)ACE基因多態(tài)性分析表明，從28個(gè)核心家系中的CHD病人及雙親中共檢出2種等位基因，分別計(jì)算病例組和父母組的基因型和等位基因的數(shù)目和頻率分布。

2．1 ACE基因型在核心家系中分布的Hardy－Wemberg平衡檢驗(yàn)無(wú)論是病人還是雙親的ACE基因型分布頻率觀測(cè)值與預(yù)計(jì)值差異都不顯著(雙親X＜sup>2＜/sup>=0.0896，病人X＜sup>2＜/sup>=0.317 2，P＞0.20)，均符合Hardy－Welnberg平衡。說(shuō)明樣本來(lái)自一個(gè)較大的、處于隨機(jī)婚配平衡狀態(tài)的群體，具有一定代表性。

2．2 單體型相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析對(duì)28個(gè)核心家系的資料采用基于單體型HHRR方法，計(jì)算出冠心病與ACE等位基因關(guān)聯(lián)性，其中在血瘀證家系中的ACE(2N)個(gè)等位基因中，16(w)個(gè)D基因發(fā)生傳遞，12(Y)個(gè)未傳遞；44個(gè)I基因中20(X)個(gè)發(fā)生傳遞，24(z)個(gè)未發(fā)生傳遞。經(jīng)X＜sup>2＜/sup>檢驗(yàn)，提示冠心病血瘀證與ACE的D基因多態(tài)性無(wú)關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。

2．3 傳遞不平衡檢驗(yàn)分析TDT法在于檢驗(yàn)零假設(shè)(Q=1/2)，若拒絕該假設(shè)可認(rèn)為兩位點(diǎn)連鎖。本組資料中符合TDT分析的血瘀證家系15個(gè)，等位基因D從雜合子父母向子代傳遞了10次，未傳遞5次，等位基因從雜合子父母向子代傳遞了5次，未傳遞10次。按X＜sup>2＜/sup>=(b-c)＜sup>2＜/sup>/(b+c)=1(P＞0.05)；結(jié)果提示，冠心病血瘀證易患位點(diǎn)可能與ACE的D等位基因位點(diǎn)不連鎖(P＞0.05)。

3 討 論

冠心病是威脅人類健康的重要疾病。流行病學(xué)調(diào)查、疾病監(jiān)測(cè)和死因統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，冠心病發(fā)病和死亡在世界范圍內(nèi)仍呈上升趨勢(shì)。目前從微觀水平探討冠心病發(fā)病的遺傳易患機(jī)制是進(jìn)行其病因研究的主要手段之一。而冠心病是一種復(fù)雜性的多基因疾病，更傾向于應(yīng)用遺傳易患性和危險(xiǎn)因素的概念。目前據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、雙胞胎研究以及家系調(diào)查結(jié)果均表明冠心病有明顯的家族傾向。據(jù)遺傳流行病學(xué)研究顯示，冠心病一級(jí)親屬的發(fā)病危險(xiǎn)較非冠心病者增加了2倍～10倍，冠心病存在家族聚集性，且親屬CHD發(fā)生越早，該個(gè)體罹患冠心病的危險(xiǎn)越高。

以往通過(guò)對(duì)54例冠心病血瘀證先證者和54例健康人進(jìn)行家系遺傳分析，提示子女患冠心病血瘀證與親代雙方患病有因果關(guān)系。冠心病血瘀證可能是一種具有遺傳傾向的“多基因證”。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，同一種疾病在不同個(gè)體多表現(xiàn)為不同的證型，現(xiàn)代遺傳學(xué)也認(rèn)為臨床上呈現(xiàn)不同程度的異質(zhì)性都是病人個(gè)體基因組結(jié)構(gòu)和功能差異的反映。DNA多態(tài)性既可作為遺傳病病因，又可作為遺傳標(biāo)記應(yīng)用。中醫(yī)證候的臨床表現(xiàn)可能與疾病的易患基因多態(tài)性之間存在相關(guān)性，CHD血瘀證為冠心病常見(jiàn)證型，與脂質(zhì)代謝紊亂、凝血機(jī)制的異常、血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有關(guān)。因此在易患基因定位研究中選擇何種方法至關(guān)重要，直接影響到能否發(fā)現(xiàn)易患位點(diǎn)。群體關(guān)聯(lián)分析、家系連鎖分析、家系關(guān)聯(lián)研究和傳遞不平衡檢驗(yàn)這些疾病基因定位研究來(lái)探討ACE是否為CHD血瘀證遺傳易患基因是非常有必要的。

本研究在對(duì)ACE基因多態(tài)與冠心病血瘀證基因存在群體關(guān)聯(lián)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用HHRR和TDT分析方法來(lái)研究在冠心病血瘀證家系中，ACE基因多態(tài)與冠心病血瘀證是否存在關(guān)聯(lián)或與疾病基因座是否存在連鎖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在冠心病血瘀證家系中未發(fā)現(xiàn)ACE基因T/D多態(tài)與冠心病血瘀證存在關(guān)聯(lián)或與疾病基因座存在連鎖，說(shuō)明該基因座可能不是湖南漢族人群冠心病血瘀證的遺傳易患基因，而是冠心病血瘀證的發(fā)病危險(xiǎn)因素之一。

本文編輯 王雅潔