摘要：目的：研究僵蠶抗疑血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放作用的影響。方法：將不同濃度的僵蠶注射液(600μg/mL，300μg/mL，150μg/mL)加入凝血酶誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞液，觀察不同濃度的僵蠶注射液對(duì)凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放作用的影響。結(jié)果僵蠶大、中、小劑量組較凝血酶組均能明顯增加組織型纖溶酶原激活物(t－PA)活性，分別為(0.460±0.010)U/mL，(0.457±0.019)U/mL，(0.366±0.014)U/mL(P＜0.01)；同時(shí)也可降低纖溶酶原活化素抑制物(PAI)活性，降低血管性假血友病因子(yWF)含量，與凝血酶組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論：僵蠶注射液可以明顯抑制凝血酶誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞釋放作用，此作用與僵蠶的抗疑作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞：僵蠶注射液；血管內(nèi)皮細(xì)胞；疑血酶

中圖分類號(hào)：R392.5 R289.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672－1349(2007)09－0837－03

僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶(Bombyx mon，L)4齡～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌[Beauvcna bassiana(Bals)Vaill]而致死的干燥體，為傳統(tǒng)中藥，又名白僵蠶。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中已有記載，味辛、咸，性平，具有祛風(fēng)定驚、活血通絡(luò)、化痰散結(jié)等功效。應(yīng)用涉及到心腦血管、肝、腎和血液病等。在對(duì)僵蠶抗實(shí)驗(yàn)勝靜脈血栓及藥理作用研究中發(fā)現(xiàn)，僵蠶水提液體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均具有較強(qiáng)的抗凝作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較不同濃度僵蠶注射液對(duì)凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織型纖溶酶原激活物(i－PA)、纖溶酶原活化素抑制物(PAI)，血管性假血友病因子(ywF)的影響，闡述僵蠶注射液對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞釋放作用的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材 料

1．1．1 臍靜脈細(xì)胞：新生兒臍帶靜脈血由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。

1．1．2 藥物：僵蠶由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附一院藥劑科提供，制備僵蠶注射液：僵蠶勻漿化小煎，醇沉，制成注射液。pH值7.4，含量相當(dāng)于2 g/mL。

1．1．3 儀器CO₂培養(yǎng)箱(美國(guó)Format Screntific Co產(chǎn)品)，倒置相差顯微鏡(中國(guó)上海顯微鏡廠產(chǎn)品)，Multiscan酶標(biāo)儀(日本Epaan公司產(chǎn)品)。

1．1．4 試劑t－PA，PAI，yWF及凝血酶試劑盒均由上海太陽(yáng)生化公司提供。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定：取新生兒臍帶靜脈，采用0.25％胰蛋白酶消化和機(jī)械性刺激獲取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，原代培養(yǎng)。經(jīng)Ⅷ因子免疫熒光檢查并選用生長(zhǎng)良好的第2代～第5代內(nèi)皮細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)分組：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)24 h－48h后培養(yǎng)板內(nèi)已有80％的細(xì)胞呈匯合狀態(tài)時(shí)，加藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分5組：凝血酶(5.0 kU/L)組，僵蠶大劑量組(凝血酶5.0kU/L+僵蠶600μg/mL)，僵蠶中劑量組(凝血酶5.0 kU/L+僵蠶300 μg/mL)；僵蠶小劑量組(凝血酶5.0 kU/L+僵蠶150μg/mL)，以及無(wú)凝血酶及僵蠶的空白對(duì)照組。每組實(shí)驗(yàn)做6個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)12 h。

1．3 測(cè)定指標(biāo)與方法t－PA，PAI活性測(cè)定均用發(fā)色底物法，yWF含量測(cè)定用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，PAI活性用抑制單位每毫升(AU/mL)表示。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量資料以均數(shù)上標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件作力差分析和直線回歸及t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 僵蠶對(duì)凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放PAI，t－PA，yWF的影響僵蠶大、中、小劑量組均能明顯增加t－PA活性，降低PAI活性，降低yWF含量，與凝血酶組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2．2 僵蠶對(duì)凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放反應(yīng)的影響程度按下列公式計(jì)算：影響率=(凝血酶加僵蠶組－凝血酶組)/(凝血酶組空白組)×100％。

僵蠶小、中、大劑量組對(duì)凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放t－PA的影響率分別為55.1％，95.6％，96.8％，對(duì)PAI的影響率分別為29.3％，85.4％和92.5％，對(duì)yWF的影響率分別為67.9％，93.1％與94.8％。結(jié)果顯示，僵蠶大劑量組對(duì)凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放t－PA具有明顯促進(jìn)作用，同時(shí)對(duì)PAl和yWF的釋放具有明顯抑制作用。

3 討 論

近年來(lái)研究表明，血栓形成機(jī)制與血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、抗凝、纖溶機(jī)制密切相關(guān)。凝血酶不但使纖維蛋白原凝固成纖維蛋白，還可以刺激血小板活化釋放，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)促凝活性，如表達(dá)組織因子(TF)、PAI和內(nèi)皮細(xì)胞yWF，并使內(nèi)皮細(xì)胞抗血栓性降低，如t－PA釋放，誘導(dǎo)其表面凝血酶調(diào)節(jié)蛋白下調(diào)等。故凝血酶在血栓形成過(guò)程中具有多項(xiàng)作用，為其病理過(guò)程中的最后樞紐。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是一個(gè)高度活躍的代謝庫(kù)，它既能合成和釋放多種抗栓、溶栓成分，如血栓調(diào)節(jié)蛋白TM、t－PA、硫酸乙酰肝素等，具有抗血小板聚集、擴(kuò)張血管和促纖溶作用。又能在受到刺激或損傷時(shí)經(jīng)凝血酶誘導(dǎo)釋放多種促血栓形成物質(zhì)，如凝血因子、內(nèi)皮素、PAI，且抗血栓性降低，如使t－PA和前列環(huán)素(PGI₂)釋放減少而引起血栓形成，動(dòng)脈粥樣硬化，微循環(huán)調(diào)節(jié)障礙，血流狀態(tài)改變。因此，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞抗栓和促栓功能的平衡對(duì)于心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸具有重要的意義。

yWF具有加速血小板黏附、聚集、介導(dǎo)血小板釋放相關(guān)因子，干擾纖溶過(guò)程，促進(jìn)血管平滑肌纖維化、動(dòng)脈粥樣斑塊及血栓形成，且與疾病的輕重呈芷相關(guān)。因此，yWF破認(rèn)為是心血管疾病的一個(gè)高危因素，并被建議作為血管內(nèi)皮細(xì)胞損害的標(biāo)志物。t－PA與PAI為纖溶系統(tǒng)的重要組成部分，t－PA活性低下或PAI活性增高是血栓形成的一個(gè)促進(jìn)因素?，F(xiàn)代藥理研究表明僵蠶具有抗凝、抗血栓、促纖溶作用。

本研究證明僵蠶可明顯提高體外培養(yǎng)凝血酶誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中的t－PA活性，降低PAI活性，使纖溶系統(tǒng)的活性增高，同時(shí)降低yWF含量，提示僵蠶具確明顯的抗凝活性，且呈劑量依賴性，為有效的抗凝藥物。據(jù)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僵蠶炮制后總蛋白質(zhì)、氫基酸和草酸銨含量明顯增高，分別達(dá)24％，14％和32％以上，而其相應(yīng)的凝血酶時(shí)間延長(zhǎng)達(dá)42％以上，表明這些成分含量越高，其凝血酶時(shí)間越長(zhǎng)。另有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，凝血酶時(shí)間與紫外光光度法測(cè)定的僵蠶蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)，提示僵蠶的主要活性成分可能是蛋白質(zhì)和草酸銨。有待進(jìn)一步深入研究，使其發(fā)展成為可供臨床使用的抗凝血酶新藥。

本文編輯 王雅潔