摘要：目的：觀察益氣養(yǎng)陰、活血化瘀方對病毒性心肌病小鼠心肌基質(zhì)全屬蛋白酶1(matrix metalloprotemase－1，MMP－1)mRNA表達(dá)的影響。方法采用反復(fù)腹腔注射柯薩奇B_3m病毒的方式復(fù)制動物模型，270只Balb/c小鼠隨機分為5組，空白組30只，模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組各60只；HE和VG染色觀察小鼠心肌形態(tài)學(xué)變化；RT-PCR法檢測心肌組織MMP－1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：益氣養(yǎng)陰、活血化瘀萬能明顯改善病毒性心肌病小鼠心肌病理形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化，下調(diào)心肌組織MMP－1 mRNA的表達(dá)水平，以中藥高劑量組效果最顯著，MMP－1為0.35±0.11。結(jié)論：益氣養(yǎng)陰、活血化瘀方能通過下調(diào)MMP－1 mRNA的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解及心肌重構(gòu)，這可能是其防治病毒性心肌病的作用機制之一。

關(guān)鍵詞：益氣養(yǎng)陰、活血化瘀方；病毒性心肌??；基質(zhì)金屬蛋白酶

中圖分類號：R542.2 R285.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672－1349(2007)09－0839－03

近年來的研究認(rèn)為，病毒感染及其介導(dǎo)的免疫損傷參與了病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)與擴張型心肌病(ddatedcardromyopathy，DCM)的發(fā)生與發(fā)展，并可能是VMC演變?yōu)镈CM的一個重要原因，可將二者統(tǒng)稱為病毒性心肌病(vualmyocardml dsease，VMD)。本研究通過建立柯薩奇病毒重復(fù)感染致病毒性心肌病的動物模型，觀察益氣養(yǎng)陰、活血化瘀方對小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)及基質(zhì)金屬蛋白酶－1(MMP－1)mRNA表達(dá)水平的影響，初步探討其作用機制，為尋求中醫(yī)藥治療VMD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物、病毒及藥物：雄性Balb/c小鼠270只，(3～4)周齡，由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供?？滤_奇B_3m病毒(CVB_3m)由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)克山病研究所提供，在Hela細(xì)胞中測50％組織感染率(TCID50)為10。益氣養(yǎng)陰、活血化瘀方由黃芪、紅參、生地黃、麥冬、五味子、川芎、丹參、等藥物組成。中藥經(jīng)水提取，制成浸膏，含水量為21％。用蒸餾水稀釋，調(diào)整濃度為82％，即相當(dāng)于每毫升懸液中含生藥4.3 g備用，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室提供。馬來酸依那普利由揚子江藥業(yè)集團江蘇制藥股份有限公司生產(chǎn)(批號：05080301)。

1．2 主要試劑與儀器RNA，cDNA，PCR試劑盒均為(美國Promega公司生產(chǎn))，NMP－1和β－actin引物(上海捷倍思基因有限公司)，透射電子顯微鏡(美國FEI TECAIG公司)，普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympas公司)，輪轉(zhuǎn)式組織切片機(德國萊卡公司)，DYY－8B電泳儀(北京醫(yī)療設(shè)備廠)，EPPERFOR2002型梯度PCR儀(德國LEICA VLTRACUT公司)等。

1．3 實驗分組與模型制備：240只Balb/c小鼠隨機分為4組：模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組，每組各60只。另取30只小鼠作為空白組。模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組均于實驗1d，8d，15d，22d，36d，50d時給予腹腔注射RM1640液稀釋的0.1 mL10^-4 TCID50 CVB_3m，0.1 mL10^-3TCID50 CVB_3m，0.2mL10^-3 TCID50 CVB_3m，0.1 mL10^-3TCID50 CVB_3m，0.1 mL10^-3TCID50 CVB_3m，0.1 mL10^-3TCID50 CVB_3m空白組給予同體積的RM1640液。

1．4 給藥及取材方法：各組均于末次病毒注射后10 d，即實驗的第60天開始灌胃。中藥低、高劑量組分別給予益氣養(yǎng)陰、活血化瘀方混懸液灌胃，中藥低劑量組10.35 g/(kg·d)；中藥高劑量組20.70 g/(kg·d)，以上給藥劑量均為生藥量。西藥組按1.3 mg/(kg·d)灌服用蒸餾水稀釋的濃度為0.65％的馬來酸依那普利混懸液。模型組和空白組灌以同體積蒸餾水。每日1次灌胃，連續(xù)4周。實驗結(jié)束時，無菌取出小鼠心臟，4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗血污，濾紙吸干，電子天平稱取心臟重量。沿左室長軸將心臟一分為二，一半置70℃冷凍保存，另一半再一分為二，1/2置4％多聚甲醛中固定，1/2置3％戊二醛中固定。1 5病理學(xué)檢測HE染色觀察心肌的病理學(xué)改變，VG染色觀察心肌間質(zhì)膠原纖維變化。

1．6 心肌組織總RNA的提取：每例心臟組織標(biāo)本各取100mg，采用Tnzol一步法提取心肌總RNA，在紫外分光光度儀下洲定A₂₆₀與A₂₈₀值，計算RNA濃度。

1．7 RT－PCR取RNA 5μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。再以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液1μg作為模板，加入相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴增。

1．8 統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組均數(shù)間的比較應(yīng)用方差分析，兩兩比較應(yīng)用q檢驗。

2 結(jié) 果

2．1 小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)變化：與空白組相比，模型組及中藥低劑量組小鼠心臟/體重比值均明顯增高(P＜0.05)，而中藥高劑量組、西藥組與空白組相比也有增高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；與模型組相比，中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組小鼠心臟/體重比值均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，其中尤以中藥高劑量組和西藥組明顯(P＜0.01)。

2．2 心肌組織HE染色結(jié)果：空白組小鼠心肌纖維排列整齊，間質(zhì)血管無改變，未見心肌細(xì)胞變性、壞死；模型組小鼠心肌纖維排列紊亂、斷裂，心肌細(xì)胞肥大，空泡變性，血管充血出血，少量炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)纖維化明顯，中藥低劑量組小鼠心肌纖維排列較紊亂，心肌細(xì)胞空泡變性，血管充血出血，少量炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)輕度纖維化；中藥高劑量組小鼠心肌纖維排列紊亂較輕微；未見心肌斷裂，血管充血出血，少量炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)纖維化程度輕微，西藥組小鼠心肌纖維排列輕微紊亂，未見心肌斷裂，血管充血出血，少量炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)纖維化程度輕微。

2．3 心肌組織VG染色結(jié)果：空白組小鼠心肌內(nèi)偶見被染成紅色的極纖細(xì)的膠原纖維；模型組小鼠心肌明顯可見大量的膠原纖維圍繞在壞死心肌周圍；中藥低劑量組小鼠心肌可見較大量的膠原纖維，范圍較廣；中藥高劑量組小鼠心肌可見血管間質(zhì)有少量膠原纖維聚集；西藥組小鼠心肌可見血管間質(zhì)有較少量膠原纖維聚集。以上結(jié)果提示病毒感染小鼠心肌病灶的局部膠原結(jié)締組織增生，間質(zhì)纖維化。用圖像分析系統(tǒng)對各組膠原容積分別進(jìn)行計算。

2．4 小鼠心肌組織MMP－1 mRNA表達(dá)檢測結(jié)果

2．4．1 小鼠心肌組織MMP－1mRNA電泳條帶比較各組β－actm電泳條帶亮度一致，擴增片段均為450bp。MMP－1mRNA在瓊脂糖電泳凝膠上紫外燈下觀察均可見387 bp片段，但各組電泳條帶亮度有明顯差異。

2．4．2 小鼠心肌組織MMP－1 mRNA電泳產(chǎn)物灰度掃描值變化與空白組相比，各組小鼠心肌組織MMP-1 mRNA表達(dá)升高(P＜0.05)；與模型組相比，中藥低劑量組心肌組織MMP－1mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)，而中藥高劑量組、西藥組心肌組織MMP-1 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.01)；中藥高劑量組、西藥組與中藥低劑量組相比，心肌組織MMP－1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。

3 討 論

目前病毒性心肌病動物模型制作主要包括如下幾種類型．一類是自發(fā)性心肌病模型，另一類是應(yīng)用物理、化學(xué)及藥物誘發(fā)的心肌病模型，再一類是利用分子生物學(xué)的方法(如轉(zhuǎn)基因)誘導(dǎo)心肌病模型。物理誘導(dǎo)的方法如李佳等采用心房快速起搏致擴張型心肌病犬模型，白融等采用快速心室起搏制備擴張型心肌病心力衰竭犬模型等?；瘜W(xué)誘導(dǎo)的方法如袁王景等采用腺苷酸轉(zhuǎn)位酶誘導(dǎo)自身免疫性的心肌病小鼠。藥物誘導(dǎo)的方法多用呋喃唑酮、阿霉素等。此外，就是反復(fù)病毒注射誘導(dǎo)的病毒性心肌病模型。文獻(xiàn)報道致病毒性慢性心肌損傷動物模型大多采用柯薩奇B病毒小劑量多次腹腔注射的方式，從而形成病毒持續(xù)感染的狀態(tài)，模擬類似于人類的病毒性心肌病的病變情況。

心臟組織中的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成和降解處于嚴(yán)格的調(diào)控之下，當(dāng)這種平衡被破壞，心臟的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能就會受影響。正常心臟膠原合成是一個動態(tài)的過程，合成增加和(或)降解減弱均導(dǎo)致膠原累積，但心室重塑的意義不僅在于膠原的量變，更重要的是心肌基質(zhì)膠原網(wǎng)破壞、消失。心室重塑是VMD的重要病理過程?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是基質(zhì)膠原代謝的重要蛋白酶，其活性及平衡受到破壞，必然導(dǎo)致基質(zhì)膠原代謝紊亂，ECM積聚，心肌細(xì)胞滑移，最終導(dǎo)致心室重塑。本研究發(fā)現(xiàn)與空白組相比模型組大鼠心肌MMP－1mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，心臟/體重比值增高(P＜0.05或P＜0.01)，心肌膠原容積分?jǐn)?shù)明顯增高(P＜0.01)，心肌纖維排列紊亂、斷裂，間質(zhì)纖維化明顯，說明在VMD的病理過程中，MMP－1水平上調(diào)，MMP－1的相對量和(或)活性增加，促使膠原纖維增生，心室重量增加，從而導(dǎo)致心肌重塑。與模型組相比，中藥低劑量組、中藥高劑量組小鼠心臟/體重比值均降低(P＜0.05)；心肌膠原容積分?jǐn)?shù)明顯降低(P＜0.01)；中藥低劑量組心肌組織MMP－1 mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)或P＜0.01)；且中藥低劑量組、中藥高劑量組較模型組心肌病理改變輕微?？梢娨鏆怵B(yǎng)陰、活血化瘀方可能是通過下調(diào)MMP－1表達(dá)水平，從而抑制心肌膠原纖維增生及心肌間質(zhì)纖維化，改善VMD病理形態(tài)的變化而起到保護(hù)心肌的作用，這可能是其防治VMD的作用機制之一。

本文編輯 王雅潔