摘要：目的觀察癡癇靈顆粒對(duì)戊四唑致癰大鼠腦內(nèi)C－fos及熱休克蛋白－70(hsp－70)含量的影響。方法隨機(jī)將72只大鼠分力6組，通過與陽(yáng)性藥物組及模型組的比較，研究癲癇靈顆粒抗癲癇作用的機(jī)制。結(jié)果：研究表明癲癇靈顆粒可顯著減輕大鼠癲癇發(fā)作，可使戊四唑致痛大鼠的大腦中減少C－fos蛋白釋放，降低hsp－70在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)。結(jié)論：癲癇靈顆粒具有良好的抗癲癇效果，可減輕大鼠癲癇發(fā)作對(duì)大腦的損傷。

關(guān)鍵詞：癲癇靈顆粒，C－fos，蛋白；熱休克蛋白－70

中圖分類號(hào)：R392.5 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672－1349(2007)09－0827－02

本實(shí)驗(yàn)通過觀察戊四唑(PTZ)致癇大鼠腦內(nèi)C－fos蛋白及熱休克蛋白－70(hsp－70)含量的變化，探討癲癇靈顆粒對(duì)戊四唑致癇大鼠抗癲癇的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠72只，雌雄各半，體重200g±12g，黑龍汀中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1．2 藥物、試劑與儀器戊四唑，使用前2 h用生理鹽水配制；癲癇靈顆粒(組方：天麻、鉤藤、石決明、柴胡、天竹黃、磁石、生龍骨、甘草等)，由黑龍江中醫(yī)研究院制劑室提供；卡馬西平由上海第六制藥廠提供，一抗由博士德生物工程有限公司提供，二抗由中杉生物工程有限公司提供；輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī)，徠佧2135型，德國(guó)，研究用生物顯微鏡，OLYMPUSBX60，日本；CMIAS系列數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，Motic Med 6.0，中國(guó)。

1．3 方法72只大鼠隨機(jī)均分為6組，每組12只，分別為空白組、模型組、卡馬西平對(duì)照組、癲癇靈高劑量組、癲癇靈中劑量組、癲癇靈低劑量組。其中空白組、模型組予飼雙蒸水2 mL/d，卡馬西平對(duì)照組組予卡馬西平9 mg/(kg·d)，癲癇靈組高、中、低劑量組濃度按9:3:1配制，分別飼藥14 d。第15天除空白組外均予戊四唑50 mg/kg腹腔注射，對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察，于1 h后腹腔注射10％水合氯醛麻醉，開胸暴露心臟，升主動(dòng)脈插管，以生理鹽水250 mL和含體積分?jǐn)?shù)為25％的戊二醛、20 g/L多聚甲醛的0.1mol/L PBS固定后，斷頭活殺，迅速取出全腦，沿腦正中矢狀切開，取一半大腦于相同固定液中固定24 h(4℃)，次日以40/μm厚度進(jìn)行冷凍切片，行連續(xù)冠狀切片，檢測(cè)皮質(zhì)內(nèi)C－fos蛋白及hsp－70。

1．4 觀察項(xiàng)目參考Racme癲癇發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)觀察觀察大鼠癲癇發(fā)作分級(jí)并記錄，運(yùn)用CMIAS系列數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像與分析系統(tǒng)記錄各組C-fos蛋白及hsp－70陽(yáng)性細(xì)胞密度。

1．5 大鼠驚厥發(fā)作評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 參考Racme癲癇發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，0級(jí)：無反應(yīng)；Ⅰ級(jí)：節(jié)律性嘴和面部抽動(dòng)；Ⅱ級(jí)：點(diǎn)頭或甩尾；Ⅲ級(jí)：?jiǎn)沃閯?dòng)；Ⅳ級(jí)：多肢抽動(dòng)和強(qiáng)直；Ⅴ級(jí)：全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS10.0軟件處理數(shù)據(jù)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2．1 大鼠行為學(xué)觀察。

2．2 C－fos蛋白及hsp－70含量

3 討 論

癲癇的病因病機(jī)十分復(fù)雜，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其歸屬于癇證范疇。其病因有先后天之分，而又強(qiáng)調(diào)七情為患。傳統(tǒng)認(rèn)為風(fēng)陽(yáng)痰濁蒙蔽心竅，流竄經(jīng)絡(luò)，是造成癇證發(fā)作的基本病理因素。對(duì)癲癇單純部分性發(fā)作多從肝風(fēng)夾痰論治，本證型的臨床特征是發(fā)作時(shí)意識(shí)尚清，或突然神呆，兩目凝視，可見手足抽動(dòng)，或見煩渴、自汗、顏面潮紅、腹痛吐瀉、妄聽妄視等種種見證，多伴有面色蒼白、倦怠乏力、納呆、大便秘結(jié)或溏泄、舌苔自膩、脈弦滑等肝風(fēng)夾痰的臨床表現(xiàn)。而癲癇靈顆粒組方中天麻、鉤藤、石決明平肝熄風(fēng)，柴胡疏肝解郁、推陳致新，天竹黃化痰定驚，生龍骨、磁石潛陽(yáng)安神，甘草調(diào)和諸藥。全方共奏平肝潛陽(yáng)、鎮(zhèn)靜安神之功。

本實(shí)驗(yàn)中選擇了戊四唑致病大鼠模型，它是目前應(yīng)用較多的大鼠癲癇模型之一，PTZ是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，功能減弱可使神經(jīng)元過度興奮，引起癲癇發(fā)作。正常對(duì)照研究表明，腹腔給予PTZ(50 mg/kg)后1 min－2 mm即可引起動(dòng)物Ⅱ級(jí)癲癇發(fā)作，且發(fā)作頻繁，可持續(xù)1 h以上。這個(gè)模型類似于癲癇單純部分性發(fā)作。

神經(jīng)遞質(zhì)受體信號(hào)通過細(xì)胞內(nèi)第二信使系統(tǒng)可以直接引起一些基因的轉(zhuǎn)錄，也可以迅速激活某些調(diào)節(jié)基因，并表達(dá)出相應(yīng)的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，再通過這些調(diào)節(jié)蛋白選擇性結(jié)合于有關(guān)DNA，引起另一些基因(次級(jí)靶基因)的表達(dá)，從而較長(zhǎng)時(shí)間地改變神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)?，F(xiàn)已證明C－fos，C－jun等即屬這類調(diào)節(jié)基因。它們?cè)谏窠?jīng)沖動(dòng)、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等外界刺激信號(hào)傳人的數(shù)分鐘內(nèi)即可作出反應(yīng)進(jìn)行表達(dá)。這些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白也稱核內(nèi)第三信使。它們?cè)谄湫畔鬟f過程中起著重要作用。神經(jīng)元興奮可導(dǎo)致C－fos蛋白快速、大量、一過性表達(dá)，因此，C－fos蛋白的表達(dá)可作為細(xì)胞水平神經(jīng)元興奮的特異性標(biāo)記物。用免疫組織化方法顯示C－fos蛋白是目前使用的機(jī)能形態(tài)學(xué)方法之一。有研究發(fā)現(xiàn)C－fos基因存在于哺乳動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)，在神經(jīng)系統(tǒng)癇性活動(dòng)情況下可被快速誘導(dǎo)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的可塑性變化和效應(yīng)基因表達(dá)的永久性改變。對(duì)突變體癲癇易感小鼠研究發(fā)現(xiàn)，在癲癇發(fā)作期間C－fos基因顯著表達(dá)，同時(shí)在小鼠大腦海馬CA1區(qū)和頂葉皮質(zhì)能檢測(cè)到細(xì)胞DNA的斷裂，認(rèn)為伴隨癲癇的發(fā)作有C－fos基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物C－fos蛋白所誘發(fā)的激活作用的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，它在凋亡最初的激活和最后的失活過程中導(dǎo)致了DNA的斷裂，參與了癲癇病灶的形成。

而hsp－70是機(jī)體在遭受各種刺激后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的一組應(yīng)激蛋白。hsp－70是熱休克蛋白中最保守和最主要的一類，在細(xì)胞應(yīng)激后生成最為顯著，被認(rèn)為對(duì)神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。當(dāng)神經(jīng)元受損時(shí)，hsp－70表達(dá)后分別在胞漿和胞核中同變性蛋白結(jié)合，防止變性蛋白進(jìn)一步折疊，促使其恢復(fù)或加速其降解和消除，維持神經(jīng)元內(nèi)蛋白自穩(wěn)，以維護(hù)細(xì)胞的功能和生存。目前，神經(jīng)元受損時(shí)，hsp－70表達(dá)對(duì)受損神經(jīng)元的保護(hù)作用已基本肯定，因此，hsp－70在腦內(nèi)表達(dá)的速度及數(shù)量在一定程度上影響神經(jīng)元對(duì)癲癇興奮性損傷的耐受性，并可能是癲癇腦內(nèi)神經(jīng)元選擇性脫失的內(nèi)在機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)中癲癇靈顆粒對(duì)戊四唑致癇大鼠大腦C－fos蛋白及hsp－70的合成有明顯抑制作用，能夠顯著控制癲癇發(fā)作，減輕神經(jīng)元在癲癇發(fā)作時(shí)的興奮性損傷。對(duì)其具體作用途徑尚有待進(jìn)一步研究。

本文編輯 王雅潔