摘要：目的：探討體現(xiàn)痰淤同治法的中藥復(fù)方丹瓜方對(duì)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV 304)增殖及形態(tài)的影響，以揭示丹瓜方在防治糖尿病高血糖致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用。方法：以標(biāo)準(zhǔn)的M199培養(yǎng)液、高糖(22.22 mmol/L)培養(yǎng)液、不同濃度的丹瓜方培養(yǎng)液、高糖加不同復(fù)方丹瓜方培養(yǎng)液培養(yǎng)ECV 304，觀察內(nèi)皮細(xì)胞生長情況及顯微形態(tài)變化。結(jié)果：不同濃度丹瓜方對(duì)培養(yǎng)ECV 304細(xì)胞的增殖、形態(tài)都具有明顯影響，濃度越高對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯；不同濃度丹瓜方均具有促進(jìn)培養(yǎng)的ECV304多形性及“偽足樣”結(jié)構(gòu)形成作用，適當(dāng)?shù)す戏綕舛?如1/450)作用顯著；過高據(jù)(22.22mmol/L)，相當(dāng)于臨床重度高血糖的糖尿病病人對(duì)培養(yǎng)的ECV 304也具有抑制作用；丹瓜方和過高糖對(duì)細(xì)胞的抑制作用不形成疊加。結(jié)論：丹瓜萬對(duì)培養(yǎng)的ECV304具有明顯的抑制增殖作用，對(duì)細(xì)胞形態(tài)也有明顯的影響。

關(guān)鍵詞：痰瘀同治；丹瓜方；血管內(nèi)皮細(xì)胞；動(dòng)脈粥樣硬化；糖尿病

中圖分類號(hào)：R587.1 R289.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672－1349(2007)09－0844－03

痰瘀同治法臨床廣泛用于糖尿病慢性并發(fā)癥的治療。糖尿病病人痰瘀同病者相當(dāng)常見，是導(dǎo)致糖尿病慢性并發(fā)癥泛發(fā)的基礎(chǔ)。及時(shí)合理應(yīng)用痰瘀同治法，能有效地預(yù)防和治療糖尿病的多種慢性并發(fā)癥，尤其是慢性血管并發(fā)癥。為此我們對(duì)丹瓜方進(jìn)行系列研究，本研究著重對(duì)丹瓜方培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及形態(tài)的影響進(jìn)行觀察。

1 材料與方法

1．1 內(nèi)皮細(xì)胞：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)，購于武漢大學(xué)典型物保藏中心(美國ATCC產(chǎn)品)。

1．2 丹瓜方組方：丹參、川芎、瓜蔞、薤白等按等比組成，所有中藥材均經(jīng)專業(yè)人士鑒定，由福建中醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院制劑室制成1.1藥液，加壓蒸氣滅菌。該制劑電解質(zhì)經(jīng)測定均在人血液電解質(zhì)正常值波動(dòng)范圍。不含重金屬。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組

1．3．1 不同濃度丹瓜方加高糖培養(yǎng)的比較，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)組：月標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液培養(yǎng)。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液以M199培養(yǎng)基加入10％胎牛血清、雙抗、超蒸水，并加NaHCO₃調(diào)整pH值。全培養(yǎng)液含葡萄糖濃度為5.55 mmol/L。高糖培養(yǎng)組：葡萄糖濃度為22.22 mmol/L，余同標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)組。1/150中藥加高糖組：高糖培養(yǎng)液每150 mL中含1.1丹瓜方液1 mL(相當(dāng)于原生藥1g)。1/300中藥加高糖組，高糖培養(yǎng)液每300mL中含1.1丹瓜方液1mL。

1．3．2 不同濃度丹瓜方、單獨(dú)高糖培養(yǎng)間的比較，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)組同前實(shí)驗(yàn)；高糖培養(yǎng)組同前實(shí)驗(yàn)；1/150中藥培養(yǎng)組：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液每150mL中含1.1丹瓜方液1mL，1/300中藥培養(yǎng)組：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液每300mL中含1.1丹瓜方液1mL；1/450中藥培養(yǎng)組：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液每450 mL中含1.1丹瓜方液1mL。各組培養(yǎng)液pH值均控制在7.2～7.6。

1．4 傳代與培養(yǎng)方法：吸掉舊培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞兩次。加入胰酶溶液(1 mL/25cm²，2 mL/75cm²)，作用4 min～7/min，于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞皺縮、變圓、彼此分離或呈大片狀分離，即加入適量含血清的培養(yǎng)液終止消化。反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液，并于倒置顯微鏡下觀察確定。用吸管將懸液移入離心管中，以1 000 r/mm轉(zhuǎn)速離心4 min～5min 。去掉上清液，加入相應(yīng)的新培養(yǎng)液，吹吸混勻成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量按比例接種到新的培養(yǎng)瓶，放入37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第三代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)，每6 h觀察記錄1次。

2 結(jié) 果

2．1 不同濃度中藥加高糖培養(yǎng)的比較ECV304細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，長勢良好，分布均勻，細(xì)胞飽滿、大小一致，呈橢圓形或梭形。繼續(xù)培養(yǎng)至第3天，細(xì)胞貼滿了整個(gè)培養(yǎng)面。同期的高糖，細(xì)胞分布較雜亂，胞體較瘦小，細(xì)胞質(zhì)色彩變淡，細(xì)胞核深黑，有細(xì)長細(xì)胞出現(xiàn)，有的形似小蝌蚪。放大觀察倍數(shù)可發(fā)現(xiàn)較多的多形細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液接近。第3天時(shí)，高糖培養(yǎng)細(xì)胞大多有黑色“偽足樣”結(jié)構(gòu)，以2支為多見，3支、4支者也常見。1/150中藥組和1/300加高糖組兩組同期細(xì)胞，細(xì)胞排列紊亂、稀疏，有的成堆，細(xì)胞數(shù)量偏少，尤其1/150中藥組為重。其他情況與高糖培養(yǎng)相似。

2．2 不同濃度中藥、單獨(dú)高糖之間的比較，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h時(shí)，與前述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液相似。高糖培養(yǎng)12 h多形細(xì)胞出現(xiàn)，胞核更黑，胞體較標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液組瘦小。單純中藥1/150組及1/300組，胞體、胞核明顯較小，細(xì)胞有成堆現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)量明顯少于標(biāo)準(zhǔn)組與單純高糖組。中藥1/450，組情況介于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)組、高糖培養(yǎng)組及1/300中藥組之間，細(xì)胞數(shù)量不少。培養(yǎng)第3天，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液細(xì)胞成梭形，少量三角形細(xì)胞，胞體飽滿，色彩均勻，細(xì)胞排列整齊。高糖培養(yǎng)組，細(xì)胞排列較紊亂，胞核更黑，有大量多形核細(xì)胞和“偽足樣”結(jié)構(gòu)細(xì)胞，形態(tài)極不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量稍少于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液組。1/150中藥組如圖10，細(xì)胞數(shù)量稀疏，胞體明顯較小，胞核小且著色較淺，有的細(xì)胞核已不明顯，細(xì)胞周圍形成小的雙層較明亮的環(huán)，細(xì)胞輪廓多不太清楚，有少量伸出“偽足樣”結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。1/300中藥組，細(xì)胞有大約1/3類似1/150中藥主體細(xì)胞形態(tài)，但伸出“偽足樣”結(jié)構(gòu)的細(xì)胞明顯更多，細(xì)胞輪廓清楚。1/450中藥組，細(xì)胞以有“偽足樣”結(jié)構(gòu)的細(xì)胞為主體形態(tài)，多形性明顯，數(shù)量及比例均多于高糖培養(yǎng)組，胞核及“偽足樣”結(jié)構(gòu)呈深黑色。第4天、第5天1/150、1/300中藥組細(xì)胞約近半數(shù)死亡，高糖培養(yǎng)組與1/450中藥組細(xì)胞成活情況相似。所有中藥組細(xì)胞均較高糖培養(yǎng)組細(xì)胞更為瘦小。

3 討 論

痰瘀是中醫(yī)基本理論體系中最具特色的病理概念之一。它既是疾病的產(chǎn)物，也是進(jìn)一步導(dǎo)致疾病發(fā)展變化的內(nèi)在原因，同時(shí)又是一種病理存在形式。因此，充分研究和認(rèn)識(shí)痰與瘀的內(nèi)涵，對(duì)于豐富和發(fā)展中醫(yī)理論，提高中醫(yī)藥防病治病的療效及科學(xué)性，都是很有意義的。糖尿病作為頗具特色的氣血津液疾病，在其病理過程中生痰生瘀幾乎是疾病進(jìn)展的常態(tài)。隨著痰與瘀作為病理產(chǎn)物逐漸產(chǎn)主，同時(shí)也作為致病因素導(dǎo)致或加重了糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生或發(fā)展。痰與瘀在糖尿病進(jìn)程中的這種特殊角色，決定了其具有進(jìn)展性、普遍性和病程相關(guān)性(病程越長越常見)特點(diǎn)。因此痰瘀同治法在糖尿病慢性并發(fā)癥的防治中具有關(guān)鍵作用，且確可能形成突破。我們?cè)陂L期臨床工作中用痰瘀同治法治療糖尿病血管神經(jīng)慢性并發(fā)癥，取得了可靠的療效。

已有體外研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的葡萄糖培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞可破壞細(xì)胞形態(tài)，抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。劉小鵬等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高糖(11 mmol/L)處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于正常血糖(5.5 mmol/L)對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)，但臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)22 mmol/L。葡萄糖作用72 h后，血管內(nèi)皮生長因子mRNA水平不再升高，而呈下降趨勢(P＜0.05)，血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達(dá)也逐漸下降。血管內(nèi)皮生長因子的生物學(xué)作用主要為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，提高血管的通透性，增加微血管特別是毛細(xì)血管后靜脈和小靜脈的滲透性及改變細(xì)胞外基質(zhì)。在某些生理或病理情況下都與血管形成和增生密切相關(guān)?？梢娺m當(dāng)高糖促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而過高葡萄糖濃度(簡稱“過高糖”，即≥22.22mmol/L)則抑制細(xì)胞增殖。本研究22.22 mmol/L的葡萄糖總體上顯示出對(duì)細(xì)胞抑制效應(yīng)，與上述研究基本符合，但發(fā)現(xiàn)過高糖促成了“偽足樣”結(jié)構(gòu)的形成，這使得培養(yǎng)細(xì)胞形成多形性的特征。不同濃度丹瓜方均對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞具有抑制作用，表現(xiàn)為胞體的瘦小及不同程度數(shù)量的減少。丹瓜方似乎具有較過高糖更為濕著的細(xì)胞增殖抑制作用。1/150丹瓜方組由于細(xì)胞成活相對(duì)較少，這種促進(jìn)作用不甚顯著，但在1/300，1/450的丹瓜方培養(yǎng)液中，隨著中藥濃度的降低，細(xì)胞成活增多，“偽足樣”結(jié)構(gòu)細(xì)胞也顯得較多。但在中藥聯(lián)合高糖培養(yǎng)情況下，未發(fā)現(xiàn)這種促進(jìn)作用的疊加。

通過本實(shí)驗(yàn)可初步得出下列認(rèn)識(shí)，不同濃度月瓜方對(duì)培養(yǎng)ECV 304細(xì)胞的形態(tài)、增殖都具有明顯影響，濃度越高對(duì)細(xì)胞的抑制作用越顯著，不同濃度丹瓜方均具有促進(jìn)培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞多形性及“偽足樣”結(jié)構(gòu)形成作用，適當(dāng)月瓜方濃度(如1/450)這種作用極為顯著；過高糖(22.22 nmLol/L，相當(dāng)于臨床重度高血糖的糖尿病病人)對(duì)培養(yǎng)的ECV304也具有抑制作用；丹瓜方和過高糖對(duì)細(xì)胞的抑制作用不形成疊加。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)具有“偽足樣”結(jié)構(gòu)的細(xì)胞列秋水仙堿細(xì)胞毒的耐受性顯著增加。

本文編輯 王雅潔