摘要：目的觀察高膽固醇血癥家兔頸動脈粥樣斑塊內(nèi)炎性巨噬細胞與MMP－2、MMP－9的表達情況，并研究氟伐他汀干預(yù)對巨噬細胞聚集和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達的影響，探索他汀類藥物在穩(wěn)定頸動脈斑塊中的作用及機制。方法24只家兔隨機分為對照組、高脂組和治療組，每組8只，分別給予普通飼料、高脂飼料和高脂飼料加氟伐他汀喂養(yǎng)，測定不同時間點血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL－c)水平。喂養(yǎng)第12周時處死動物，取頸動脈進行石蠟切片，測量并計算頸動脈I/M比值，SP法進行CD68、MMP－2和MMP－9免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果治療組血清TC、LDL－C濃度明顯低于高脂組(P＜0.01)。治療組I/M比值明顯低于高脂組(P＜0.01)。高脂組頸動脈斑塊中見大量CD68陽性細胞。而治療組CD68陽性細胞數(shù)顯著少于高脂組(P＜0.01)。頸動脈斑塊中MMP－2、MMP－9陽性細胞和染色強度明顯增加，治療組MMP－2和MMP－9的表達較高脂組顯著減少(P＝0.002和P＝0.016)。結(jié)論 氟伐他汀治療可以抑制高膽固醇血癥家兔頸動脈粥樣斑塊的形成，減輕斑塊內(nèi)巨噬細胞的浸潤并抑制MMP－2和MMP－9的產(chǎn)生，從而起到穩(wěn)定斑塊的作用。

關(guān)鍵詞：動脈粥樣硬化；頸動脈狹窄；基質(zhì)金屬蛋白酶；氟伐他??；腦梗死

中圖分類號：R543.5 R256.2 文獻標識碼：A 文章編號：1672—1349(2007)04—0324—03

動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)單核一巨噬細胞等炎性細胞聚集，合成基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)增多，可能是造成纖維帽變薄、斑塊不穩(wěn)定的重要因素^[1]。易損斑塊表面潰瘍形成、破裂，引起動脈內(nèi)血栓形成或斑塊脫落成微栓子，是缺血性卒中的主要發(fā)病機制。他汀類藥物還原酶抑制劑(HMG－CoA)可以通過減輕炎癥反應(yīng)、改善內(nèi)皮細胞功能等來阻止斑塊形成并穩(wěn)定斑塊^[2，3]，從而有效地預(yù)防和控制動脈粥樣硬化的形成，是近年研究的熱點，但其確切機制尚不明了，不同的藥物作用也不盡相同。本研究擬通過高脂飲食建立家兔動脈粥樣硬化模型，觀察頸動脈粥樣斑塊內(nèi)炎性巨噬細胞與明膠酶(MMP－2、MMP－9)的表達情況，并研究氟伐他汀干預(yù)對炎癥反應(yīng)和MMPs表達的影響，從而探索他汀類藥物在穩(wěn)定頸動脈斑塊中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立和分組 健康4月齡新西蘭白兔24只(由南通大學(xué)實驗動物中心提供)，雌雄各半，體重(2.0～2.5)kg。簡單隨機法分為3組，每組8只，對照組給予普通顆粒飼料喂養(yǎng)；高脂組予高脂飼料(1.5％膽固醇、1％豬油和4％蛋黃)；治療組的喂養(yǎng)在高脂組的基礎(chǔ)上添加氟伐他汀(來適可，北京諾華制藥有限公司)20 mg/(kg·d)。1.2血標本的留取分別于實驗開始前及開始后第4周、第8周、第12周清晨空腹取各組實驗動物耳緣靜脈血0.5 mL，酶法測定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)。

1.3 病理標本的留取和處理于第12周末放血法處死全部動物，將兔兩側(cè)頸動脈由起始處(左側(cè)起始于主動脈弓，右側(cè)起始于無名動脈)經(jīng)分叉至入顱前全部取出，清除血管外周結(jié)締組織后附面縱行剖開，肉眼觀察頸動脈斑塊形態(tài)、數(shù)量，取組織經(jīng)10％甲醛固定，進行常規(guī)石蠟制片，切片厚5um，HE染色后光鏡下觀察頸動脈粥樣斑塊，Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量頸動脈內(nèi)膜厚度(I)、中層厚度(M)并計算I/M值，每例標本在不同部位測量5次，取平均值。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法，CD68(MAB－0041)、MMP－2(MAB－0244)、MMP－9(MAB－0245)單克隆抗體(即用型)和SP試劑盒(KIT－9702)，均購自福州邁新生物技術(shù)公司。切片經(jīng)高壓鍋抗原修復(fù)，DAB染色。

1.5 免疫組化結(jié)果的評定CD68、MMP－2、MMP－9陽性定位于胞質(zhì)和胞膜，為淺黃色、棕黃色或棕褐色。在斑塊的肩部、基底部和纖維帽各隨機選取4個高倍視野(×200)，計數(shù)CD68陽性細胞，取其平均值。MMP－2和MMP－9染色結(jié)果的評定參照許良中等^[4]的判斷標準進行半定量分析，由兩位病理科醫(yī)師采用盲法評定，將染色強度打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，再將陽性細胞所占的百分比打分：0分為陰性，1分為陽性細胞≤lO％，2分為11％～50％，3分為51％～75％，4分為＞75％，根據(jù)染色強度與陽性細胞百分比的乘積分成4個等級：(－)，≤3分；(＋)，4分～6分；(＋＋)，7分～9分；(＋＋＋)，10分～12分。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料以均數(shù)±標準差

表示，SPS 10.O統(tǒng)計軟件進行方差分析，組間比較采用LSD法，等級資料的組間比較采用Kruskal－Wallis秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清學(xué)指標的變化 實驗前各組家兔血清脂質(zhì)間均無明顯差異。喂養(yǎng)第12周時，高脂組外周血TC(24.07±2.27)mmol/L、LDL－C(16.4±2.7)mmol/L水平，均顯著高于對照組的TC(1.55±1.05)mmol/L、LDL－C(0.6±0.5)mmoL/L．差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；治療組治療后均較高脂組顯著降低(P＜0.01)，各組間TG和HDL－C水平無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察 HE染色光鏡下觀察頸動脈，正常對照組內(nèi)膜見單層扁平內(nèi)皮細胞，結(jié)構(gòu)完整，中膜平滑肌細胞與內(nèi)彈力層平行，排列規(guī)整；高脂組動脈壁明顯增厚，斑塊向管腔內(nèi)突起，管腔縮小，內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮下見大量泡沫細胞，可見崩解破碎，有脂質(zhì)沉積，細胞大小不等，排列紊亂；而治療組動脈壁內(nèi)膜厚度明顯小于高脂組，內(nèi)膜完整，泡沫細胞減少，脂質(zhì)沉積少。高脂組I/M比值(1.317±0.008)較對照組(0.020±0.006)顯著增高(P＜0.01)，而治療組I/M比值(0.544±0.008)較高脂組顯著降低(P＜0.01)。

2.3 CD68陽性細胞 對照組內(nèi)膜及內(nèi)膜下僅見少量CD68陽性細胞；高脂組頸動脈斑塊中見大量CD68陽性細胞，散在分布；而治療組CD68陽性細胞數(shù)顯著少于高脂組(P＜0.01)。

2.4

MMP－2、MMP－9表達結(jié)果對照組僅見少量MMP－2、MMP－9陽性細胞。頸動脈斑塊中MMP－2、MMP－9陽性細胞和染色強度明顯增加，主要位于斑塊核心的周圍，尤其是在斑塊的肩部和纖維帽中，治療組MMP－2和MMP－9的表達較高脂組顯著減少。詳見表1。

3 討 論

動脈粥樣硬化斑塊破裂、潰瘍，引起動脈內(nèi)血栓形成或斑塊脫落成微栓子，是冠心病和缺血性卒中的主要發(fā)病機制，提高動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性，是減少急性冠脈綜合征和缺血性卒中的重要措施。易損(不穩(wěn)定)斑塊的主要形態(tài)學(xué)特征包括：巨噬細胞聚集為主的活動性炎癥、薄的纖維帽和大的脂質(zhì)核心、纖維帽的破裂等，基質(zhì)消化酶活性的增加也促成了斑塊的不穩(wěn)定性^[5]。MMPs是一組含有鈣和鋅離子的具有相同功能區(qū)域和作用機制的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白水解酶超家族，主要由間質(zhì)細胞和一些炎性細胞合成和分泌，并受多種細胞因子調(diào)節(jié)，它們在維持ECM合成與降解的動態(tài)平衡，生理性和病理性血管重建中和保持纖維帽的完整方面發(fā)揮重要作用，可能是維持斑塊穩(wěn)定的一個重要因素。在動脈粥樣斑塊中，MMP－2和MMP－9活性增強^[6]。在頸內(nèi)動脈高度狹窄的病人中，MMP－9蛋白的水平和活性與近期腦血管事件的發(fā)生顯著相關(guān)．提示其在頸內(nèi)動脈粥樣硬化斑塊纖維帽的破壞中起定作用^[7，8]。動脈粥樣斑塊內(nèi)炎性細胞主要是單核－巨噬細胞系統(tǒng)，其產(chǎn)生的主要是MMP－2和MMP－9，CD68是單核巨噬細胞的特異性抗原。本研究顯示，動脈粥樣斑塊中巨噬細胞明顯增多，高脂組MMP－2和MMP－9表達較對照組顯著增多，說明炎癥反應(yīng)以及由炎性細胞產(chǎn)生的MMPs促成了頸動脈粥樣硬化的形成，并可能進一步導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定。

他汀類藥物能有效地預(yù)防和控制動脈粥樣硬化，其主要的作用機制為阻斷膽固醇的生物合成、降低血清LDL－C濃度等。本研究中，氟伐他汀顯著降低高膽固醇血癥家兔血清TC和LDL－C濃度，同時，氟伐他汀治療顯著抑制了頸動脈粥樣斑塊的形成，I/M比值較高脂組明顯降低。近年的基礎(chǔ)和臨床研究均提示，他汀類藥物還可以通過減輕炎癥反應(yīng)、改善內(nèi)皮細胞功能等來阻止斑塊形成并穩(wěn)定斑塊^[2]，但其機制尚不明了。體外研究提示，辛伐他汀能抑制巨噬細胞表達和分泌MMP－2、MMP－9^[9，10]，而Crisby等^[11]在一項對照研究中卻發(fā)現(xiàn)，接受普伐他汀治療的病人斑塊中MMP－l和MMP－9水平與對照組沒有差別，他汀類藥物是否會影響到MMP的產(chǎn)生尚不明確。在體研究顯示，氟伐他汀治療顯著抑制了動脈粥樣斑塊內(nèi)巨噬細胞的聚集，同時，MMP－2和MMP－9表達的細胞數(shù)和量較高脂組顯著減少，這說明氟伐他汀抑制了斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)，并可能使基質(zhì)破壞減少，從而起到穩(wěn)定斑塊的作用。

本研究結(jié)果提示，氟伐他汀治療可以抑制頸動脈粥樣斑塊的形成，減輕斑塊內(nèi)炎性巨噬細胞的浸潤并抑制MMP－2和MMP－9的產(chǎn)生，從而起到穩(wěn)定斑塊的作用，進一步闡明了他汀類藥物的作用機制，同時，也為MMP抑制藥物的應(yīng)用提供了線索和依據(jù)。

參考文獻：

[1] Galis ZS，Khatri JJ．Matrix metalloproteinases in vascular remodelingand atherogenesis：The good，the bad，and the ugly[J]．Cire Res，2002，90(3)：251—262．

[2] Jain MK，Ridker PM．Anti－inflammatory effects of statins：Clinicalevidence and basic mechanisms[J]．Nat Rev Drug Discov，2005，4(12)：977—987．

[3] Stoll G，Bendszus M．Inflammation and atherosclerosis：Novel insightsinto plaque formation and destabilization[J]．Stroke，2006，37(7)：1923—1932．

[4] 許良中，楊文濤免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標準[J]．中國癌癥雜志，1996，6(4)：229—231．

[5] Nagbavi M，Libby P，F(xiàn)alk E，et al． From vulnerable plaque to vul-nerable patient：A call for new definitions and risksaessment strate-gies[J]．Circulation，2003，108(14)：1664—1672．

[6] Galls ZS，Sukhova GK，Lark MW，et al，Increased expression ofmatrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerableregions of human atherosclerotic plaques[J]．J Clin Invest，1994，94(6)：2493—2503．

[7] Loftus IM，Naylor AR，Goodall S，et al．Increased matrix metallo-proteinase－9 activity in unstable carotid plaques：A potential role in a-cute plaque disruption[J]．Stroke，2000，31(1)：40—47．

[8] Papalambros E，Sigala F，Georgopoulos S，et al．Vascular endothe-lial growth factor and matrix metalloprotdnase 9 expression in humancarotid atherosclerotic plaques：Relationship With plaque destabilizationvia neovascularization[J]．Cerebrovasc Dis，2004，18(2)：160—165．

[9] 曹雅雯，胡大一．辛伐他汀對巨噬細胞基質(zhì)金屬蛋白酶－2、9表達及分泌的影響[J]．中華心血管病雜志，2004，32(7)：640—642．

[10] 陳倩，吳宗貴，張玲珍普伐他汀對培養(yǎng)巨噬細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶活性的影響[J]．中華老年心腦血管病雜志，2003，5(5)：331—333．

[11] Crisby M，Nordin－Fredriksmn G，Shah PK，et al．Pravastatintreatment increases collagen content and decreases lipid content．in-flammation，metalloproteinases，and cell death in human carotidplaques：Implications for plaque stabilization[J]．Circulation，2001，103：926—933．

作者簡介：周永(1972—)，男，畢業(yè)于南京醫(yī)科大學(xué)，主治醫(yī)師，碩士，現(xiàn)工作于江蘇省南通市第一人民醫(yī)院(郵編：226001)；黃懷宇、黃志東、顧承志、朱向陽，工作于江蘇省南通市第一人民醫(yī)院。

(本文編輯 郭懷印)

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