中圖分類號：R285 文獻標識碼：A 文章編號：1672—1349(2007)04—0331—03

干細胞是一種具有無限自我復制能力和向多種細胞分化潛能的細胞?，F(xiàn)在被廣泛研究的有胚胎干細胞和骨髓干細胞，前者指早期胚胎的多能于細胞(pluripotent cell)，后者指存在于骨髓中的具有多向分化潛能和自我更新能力的干細胞。目前認為骨髓中至少含有兩種干細胞：造血干細胞(hematopietic stemcell，HSC)和間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)。近幾年來將干細胞定向分化的神經(jīng)細胞或神經(jīng)前體細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病受到了廣泛的關注，成為臨床和實驗研究的熱點之一。因此如何將胚胎干細胞和骨髓干細胞定向分化為神經(jīng)細胞或神經(jīng)前體細胞是研究的關鍵所在。現(xiàn)主要就干細胞定向分化為神經(jīng)細胞及中藥干預的研究現(xiàn)況作一綜述。

1 干細胞向神經(jīng)細胞的定向分化

1.1 胚胎干細胞向神經(jīng)細胞的定向誘導分化方法 目前胚胎干細胞定向分化的方法大致分為以下3類：①體外誘導法，此種方法很多，也是最為常用的，包括維A酸(維甲酸，RA)誘導、基質(zhì)細胞源性的誘導活性、生長或分化因子誘導、按譜系限制性發(fā)育控制基因的方向進行分化等。其中華盛頓大學醫(yī)學院Bain等^[1]的維甲酸4－/4＋誘導法被視為最基本的，也是最經(jīng)典的神經(jīng)細胞誘導方法。雖然維甲酸是胚胎干細胞向神經(jīng)細胞分化的有效誘導劑，但維甲酸誘導無法排除雜細胞的存在，且誘導后的神經(jīng)細胞不能增殖，存活時間也短^[2]。而譜系選擇法誘導的神經(jīng)前體細胞可以彌補這些缺陷，它使胚胎干細胞經(jīng)歷了胚胎干細胞－類胚體神經(jīng)前體細胞終末類型細胞4個過程，較之維甲酸誘導法可能更接近于胚胎正常發(fā)育過程。因此，在胚胎干細胞移植研究領域，采用譜系選擇法誘導出神經(jīng)前體細胞進行移植將是一種趨勢^[3]。②導人外源性基因，使其分化為某一特定類型的細胞。③體內(nèi)定向分化，使胚胎干細胞多數(shù)分化為該組織特異性的細胞。胚胎干細胞移植人體內(nèi)后的遷移方向和分化的細胞類型受局部微循環(huán)的影響。

為找到胚胎干細胞定向分化的最佳條件，郭雨霽等^[4]將從小鼠胚泡內(nèi)細胞團中獲取的胚胎干細胞進行體外培養(yǎng)，通過向培養(yǎng)液中分別加入維甲酸、大腦皮質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液＋維甲酸、β－巰基乙醇＋維甲酸＋大腦皮質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液，觀察胚胎干細胞向神經(jīng)細胞方向分化的情況。結果發(fā)現(xiàn)用維甲酸、β－巰基乙醇和大腦皮質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液聯(lián)合誘導胚胎干細胞，可使70％以上的胚胎干細胞分化為神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫陽性的神經(jīng)細胞。并且認為聯(lián)合應用對胚胎干細胞的誘導分化有明顯的互補和協(xié)同作用。

1.2 骨髓干細胞向神經(jīng)細胞的定向誘導分化方法定向分化為神經(jīng)細胞的骨髓干細胞是指骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSC)，又稱為骨髓基質(zhì)(干)細胞，簡稱骨髓干細胞。BMSC在合適的體外環(huán)境中可長期生長，呈成纖維樣細胞表型，可誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、骨髓基質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、肝細胞和神經(jīng)細胞等^[5，6]。BMSC具有來源廣泛、分離培養(yǎng)容易、多向分化能力、易被外源性基因轉染、植入反應低及無成瘤性等特點^[7]。雖然當前分離純化培養(yǎng)BMSC的方法很多，但骨髓細胞是一群異質(zhì)細胞，成分復雜，BMSC缺乏特異標記分子。如何進一步對BMSC進行分離純化，仍是一個亟須解決的課題^[8]。

BMSC向神經(jīng)細胞的定向分化研究主要也分體外培養(yǎng)和體內(nèi)分化兩部分。體外實驗主要是在體外培養(yǎng)基中加入抗氧化劑或者生長因子以誘導分化。如姜曉丹等^[9]采用梯度密度離心法分離獲取成人骨髓源細胞，“CYTOKINE·神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液”培養(yǎng)主要含有細胞因子：膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)(20ng/mL)、維甲酸(0.5 ug/mL)、LIF(10 ng/mL)等，發(fā)現(xiàn)成人骨髓源細胞在相應培養(yǎng)條件下快速分裂增殖為大而圓并含粗大胞質(zhì)顆粒的神經(jīng)干細胞。Iblack等^[10]。報道骨髓干細胞能夠在β－巰基乙醇、二甲基亞砜、3－叔丁基－4羥基茴香醚等抗氧化劑的誘導下分化為神經(jīng)細胞。施雪英等^[11]從大鼠股骨中分離、貼壁法體外擴增、傳代培養(yǎng)骨髓干細胞，以二巰基乙醇(2－ME)預誘導，再加入2－ME、3－叔丁基－4羥基茴香醚誘導。結果也證實2－ME、3－叔丁基－4羥基茴香醚在體外能夠有效的誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞。汪泱等^[12]將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)后，采用阿魏酸鈉對其進行誘導培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)阿魏酸鈉誘導培養(yǎng)6 h后即可見細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，24 h后表現(xiàn)為典型的神經(jīng)細胞樣形態(tài)，神經(jīng)細胞特異性標志物呈陽性表達。

骨髓干細胞能夠在體內(nèi)分化為神經(jīng)細胞，這些細胞具有廣泛遷移和位置依賴性。目前大多數(shù)體內(nèi)移植的研究都是將分離的骨髓于細胞直接移植到紋狀體、側腦室等部位，如Azizi等^[13]將BMSC注射到大鼠腦內(nèi)紋狀體區(qū)后，約20％的細胞成功存活并沿已知的神經(jīng)干細胞遷移路徑進行整合、遷移。

將5溴－2脫氧尿苷(Br－du)標記的小鼠BMSC注射到3日齡胎鼠側腦室，12 d后BMSC遷移到前腦和小腦而未破壞宿主的正常腦結構，部分分化為具有星形膠質(zhì)細胞形態(tài)、表達GFAP的細胞；有些BMSC出現(xiàn)于神經(jīng)元富集的區(qū)域如嗅球和小腦的內(nèi)顆粒層甚至腦干網(wǎng)狀結構，并向神經(jīng)元分化^[14]。Chen等^[15]將Brdu標記的大鼠骨髓(BM)細胞和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BEINF)一起移植到MCAO大鼠的腦缺血邊緣區(qū)，可見Brdu陽性細胞表達NeuN和GFAP，腦內(nèi)移植BM＋BDNF組較對照組運動和軀體感覺顯著改善。

2 中藥干預干細胞定向分化的實驗研究

目前雖然中藥干預胚胎干細胞分化的研究尚沒有報道，但是已有很多中藥干預神經(jīng)干細胞分化和骨髓干細胞定向分化的報道。現(xiàn)將目前有關此方面研究的現(xiàn)狀進行總結。

中藥促進干細胞分化的研究分為兩方面：一方面是利用有清熱瀉火、活血化瘀等藥效的單種中藥提取物來體外誘導神經(jīng)干細胞分化，如張艷君等^[16]報道黃芩苷、梔子苷能誘導神經(jīng)干細胞特異性分化成非成熟神經(jīng)元，而聯(lián)合應用補氣中藥提取物黃芪苷、活血化瘀中藥提取物三七總皂苷能明顯提高成熟神經(jīng)元的比例。提出了不同治則中藥針對損傷后神經(jīng)再生不同階段干預促進神經(jīng)元再生的概念。陳東等^[17]發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽在體外可明顯促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化。陳東風等^[18]采用大腦中動脈線拴法造成局灶性腦缺血大鼠模型，應用免疫組織化學技術檢測神經(jīng)上皮干細胞蛋白(Nestin)的表達，觀察龜板對腦缺血后神經(jīng)上皮干細胞蛋白的影響。結果表明龜板可降低神經(jīng)病評分和增強腦缺血后Nestin的表達。提示補腎中藥龜板可減輕神經(jīng)損傷癥狀和對局灶性腦缺血后神經(jīng)干細胞有促進增殖作用。沈驊睿等^[19]用仙茅水提物對大鼠骨髓間質(zhì)干細胞進行刺激，經(jīng)RT－PCR和免疫細胞化學染色檢測、倒置顯微鏡下觀察使用中藥仙茅水提物誘導刺激后的大鼠骨髓間質(zhì)干細胞的變化情況，結果RT－PCR檢測有神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的特異性蛋白神經(jīng)元烯醇酶和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達，倒置顯微鏡下觀察到有神經(jīng)元樣細胞生長，免疫細胞化學染色檢測有神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞著色。因此認為中藥仙茅水提物能定向誘導骨髓干細胞向神經(jīng)元細胞分化。并發(fā)現(xiàn)在未加任何誘導藥物的骨髓間質(zhì)干細胞對照組中也檢測到有神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和GFAP的mRNA表達，分析認為導致這種未誘導的體外神經(jīng)分化的原因是體外的血清環(huán)境和培養(yǎng)液中的高糖環(huán)境導致的。王勇等^[20]利用梯度離心從大鼠骨髓中分離單核細胞進行培養(yǎng)，去除不貼壁的細胞，分離純化，對其生長特性進行分析。采用含黃芪的無血清L－DMEM誘導分化為神經(jīng)細胞樣細胞，觀察細胞形態(tài)變化，用免疫組織化學方法檢測分化細胞中巢蛋白(nestln)、NSE、GFAP的表達。結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)黃芪誘導后，骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)發(fā)生改變，nestln、NSE和GFAP陽性，分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞樣細胞。采用含丹參注射液或硫代甘油誘導BMSC分化為神經(jīng)元，可能與丹參中含有丹參酮、總丹酚酸等多種抗氧化成分有關^[21]。

另一方面是應用血清藥理學原理，利用復方中藥血清促進神經(jīng)干細胞的分化，如楊萍等^[22]將不同濃度的肌萎靈注射液加入含5％胎牛血清的DMEM/F12的細胞培養(yǎng)液中，制成培養(yǎng)液，與用含5％胎牛血清的DMEM/F12稀釋的力如太(終濃度為10 umol/L的培養(yǎng)液)作對照，觀察二者對培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞的誘導分化能力。結果表明肌萎靈注射液和力如太均能能促進神經(jīng)于細胞向神經(jīng)元方向的分化，并且當肌萎靈注射液的濃度為1％時，其誘導能力最強。肌萎靈注射液與力如太相比較也有顯著性的差異。劉伯炎等^[23]觀察了中藥腦溢安顆粒對腦出血后神經(jīng)干細胞反應的影響，發(fā)現(xiàn)腦出血后nestin陽性細胞增多，1 d達高峰，然后逐漸降低，維持到第7天，nestin陽性細胞主要分布在海馬、皮質(zhì)區(qū)。腦溢安組與模型組3 d后各時間點存在顯著性差異，能夠維持被激活的神經(jīng)干細胞的增殖。

劉伯炎等^[24]還觀察了中藥補陽還五湯對大鼠局灶性腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞反應的影響，發(fā)現(xiàn)正常大鼠腦組織中存在少量的神經(jīng)干細胞(NSC)，主要分布在皮質(zhì)區(qū)，腦缺血后NSC增殖，以皮質(zhì)、缺血周圍區(qū)增加明顯，健側海馬區(qū)可見NSC啟動，1 d開始增多，5 d達到高峰。補陽還五湯組與模型組比較在5 d、7 d存在明顯差異，更能促進并維持NSCs的增殖。

3 問題與展望

干細胞移植治療各種疾病近年來受到了廣泛的關注，胚胎干細胞和骨髓干細胞的定向分化也成了研究的熱點之一。雖然實驗技術和方法現(xiàn)在得到了很大的改進，但是在很多方面都存在問題，如胚胎干細胞的來源、定向分化的方法的選擇、移植后免疫排斥的問題等。自體骨髓干細胞移植雖然能解決胚胎干細胞的來源困難、免疫排斥的問題，但是骨髓干細胞的分離純化困難、表達率低等也是迄待解決的關鍵所在。中藥干預的研究興起較晚，目前也僅是局限于體外實驗研究階段，不管是單藥提取還是復方制劑在體外培養(yǎng)都脫離了人體環(huán)境，這違背了中醫(yī)整體觀念和辨證論治的思維方法。但是干細胞的移植還是為臨床實踐帶來了希望，目前骨髓干細胞治療遺傳變性疾病已取得了可喜的成果。

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作者簡介：臧志萍(1978—)，女，現(xiàn)為山東中醫(yī)藥大學2004級中醫(yī)神經(jīng)內(nèi)科專業(yè)在讀博士研究生(郵編：250014)；曹曉嵐，工作于山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。

(本文編輯 郭懷印)