摘要：目的探討腦靈湯對老年性癡呆大鼠的干預機制。方法采用Y－迷宮測試大鼠的智力；采用生化法檢測大鼠血清總膽固醇(TC)含量和放射免疫法(RTA)測定大鼠腦淀粉樣前蛋白(APP)、β－淀粉樣肽(Ap)含量。結(jié)果 腦靈湯組能明顯改善老年性癡呆大鼠智力，其學習記憶能力明顯提高(P＜0.05)；血清總膽固醇及腦內(nèi)APP、Aβ含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結(jié)論腦靈湯對老年性癡呆大鼠有明顯的干預作用，其機制可能與降低血清總膽固醇、抑制APP的產(chǎn)生、減少腦組織Aβ含量，從而提高其智力能力。

關(guān)鍵詞：腦靈湯；老年性癡呆大鼠；淀粉樣前蛋白；β－淀粉樣肽

中圖分類號：R749.1 R255.2 文獻標識碼：A 文章編號：1672—1349(2007)04—0310—03

老年性癡呆(Alzheimer’s disease，AID)是一種以進行性智能減退為主要特征的老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。老年斑是其主要病理性特征之一。臨床表現(xiàn)為記憶功能喪失、智力減退和行為人格退化。腦病理研究發(fā)現(xiàn)，β淀粉樣肽(Aβ)是老年斑的核心成分，AD病人腦組織內(nèi)Aβ明顯增多，并形成大量的老年斑。老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和血管壁淀粉樣變是AD大腦的特征性病理改變，而Aβ是老年斑和血管壁淀粉樣變性的主要成分^[1，2]。為此，本實驗從益腎健脾、祛痰清瘀立法組方，觀察腦靈湯對AD大鼠血清總膽固醇(TC)及其腦內(nèi)淀粉樣前蛋白(APP)、Aβ含量的影響，從而探討其防治AD的作用機制，為臨床治療AD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用健康4月齡SD(Spragu－Dawley)大鼠72只(中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物中心提供)，雌雄各半，體重180 g～220 g。合格證號[(湘)－2004－0013]領(lǐng)回后在實驗室動物房喂養(yǎng)，喂養(yǎng)期間自由飲水和進食，保持充足的光照和通風。

1.2 實驗藥物及主要試劑腦靈湯濃縮液(由何首烏、白參、紅景天等八味藥組成)，湘雅二醫(yī)院制劑科配制，每毫升成藥液含生藥2.9 mg。舒降之(辛伐他汀片)：用前用雙蒸水經(jīng)超牛細胞粉碎機制成濃度4 g/L的混懸液，藥物配制后置4℃冰箱保存?zhèn)溆?，用前搖均(杭州默沙中制藥有限公司，20 mg×7粒)。APP的N末端抗體由Sigma公司生產(chǎn)；Aβ試劑盒天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司生產(chǎn)，血清TC試劑盒首都醫(yī)科大學首醫(yī)臨床科技中心提供。

1.3 主要儀器Y型電迷宮箱(中南大學湘雅醫(yī)學院神經(jīng)生物中心提供)，臺式高速冷凍離心機(湖南儀器儀表總廠離心機廠生產(chǎn))，微機多探頭7計數(shù)器(上海瀘西分析儀器廠生產(chǎn))，全自動生化分析儀(荷蘭威圖Selectrac生產(chǎn))，流式細胞儀(美國BECKMAN公司生產(chǎn))，紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠生產(chǎn))。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組共篩選出72只SD大鼠，再將這72只大鼠隨機分為對照組、模型組、西藥組(舒降之組)、中藥組(腦靈湯組)，每組各18只。

1.2.2 模型制備實驗大鼠喂飼高膽固醇飼料(1％膽固醇)，2周后檢測血清總膽固醇含量，給藥組開始給藥，持續(xù)8周，進行學習記憶測試，然后取血和腦組織，進行各項指標觀察，進行學習記憶測試并取血和腦組織進行檢測。對照組大鼠喂飼普通飼料。

1.3 觀察指標

1.3.1 大鼠學習記憶能力檢測 行為學測試于AID模型建立前后及腦靈湯／舒降之處理各時間段(20d及30 d)進行，均予Y－迷宮測試，方法：將大鼠放入Y－迷宮箱中，適應5min，使其熟悉－迷宮箱的3個臂的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，然后從1個臂開始隨機測試，給(30～70)V，電流(0.5～0.7)mA，電擊后大鼠逃避至安全區(qū)為正確反應，否則為錯誤反應。每測1次休息30 s，測10次休息5 min。大鼠學習記憶能力以連續(xù)10次測試中有9次為正確反應時，所需的電擊次數(shù)表示。數(shù)值越小表示大鼠的學習記憶能力越好；數(shù)值越大表示大鼠的學習記憶能力越差，記錄每只大鼠學會逃避電刺激所需的次數(shù)。若次數(shù)超過30次則不再測試，并以30次為最大值記數(shù)。

1.3.2 腦APP含量測定采用放射免疫法(RTA)：實驗大鼠采血后，斷頭處死，手術(shù)迅速將腦組織取出，冰臺上快速分離大鼠左、右半大腦，除去小腦及腦橋。用Tris－HCI緩沖液勻漿，10 000 r/min離心10 min。取上清液檢測APP含量(ng/mg)。嚴格按照天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司APP試劑盒說明書操作，結(jié)果由γ計數(shù)器得到校正的APP含量。

1.3.3 腦Aβ含量測定 斷頭處死后，冰臺上快速分離大鼠左、右半大腦，除去小腦及腦橋，加入2.5倍量的冰生理鹽水，在冰浴下超聲波破碎制成40％的勻漿，4℃低溫離心機中10000 r/min離心10 min，取上清液用放免法測Aβ的含量，按Aβ試劑盒方法操作。

1.3.4 血清TC的測定采用生化法：大鼠于末次給藥后1 h腹主動脈放血，4℃放置4 h后，3000 r/min離心20 min，取上清液，按國產(chǎn)試劑法，取10uL血清1.0 mL試劑，37℃反應10 min，于荷蘭威圖SelectraE全自動生化測定儀在520 nm比色，以試劑空白校零，計算公式為：樣品中膽固醇含量(mmol/L)=A測定／A標準x標準濃度。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 11.5進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差

表示，配對t檢驗進行組內(nèi)分析，造模前后學習記憶成績與對照組的比較采用t檢驗；藥物對腦APP含量、腦Aβ含量和血清總膽固醇含量的影響及各組治療后學習記憶成績所得數(shù)據(jù)用單因素方差分析，a=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 腦靈湯對老年癡呆大鼠學習記憶的影響(見表1) 治療后20 d、30 d各組大鼠電迷宮實驗學習記憶能力測試比較，記錄模型組和對照組大鼠造模前后Y－迷宮學習記憶成績。結(jié)果說明，喂飼高膽固醇飼料后大鼠學習記憶功能明顯減退，提示模型復制成功。但治療用藥后，腦靈湯組和舒降之組可明顯改善動物的學習記憶力，而兩組之間無明顯差異。

2.2 各組大鼠大腦組織勻漿APP、Aβ含量的比較在治療8周后斷頭取大鼠大腦組織，檢測其APP、Aβ含量，結(jié)果顯示：對照組、腦靈湯組、舒降之組腦APP、Aβ含量和模型組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。腦靈湯組與舒降之組相比較，腦APP、Aβ含量有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見表2。

2.3 腦靈湯對大鼠血清TC水平的影響 造模前受試動物的血脂水平均為正常。造模2周后，模型組與對照組比較，血清TC明顯升高(P＜0.01)，表明高膽固醇血癥造模成功。與模型組比較，腦靈湯組、舒降之組血清TC均明顯降低(P＜0.001)。與舒降之組比較，腦靈湯組血清TC明顯降低(P＜0.05)。詳見表3。

3 討 論

中醫(yī)古籍沒有老年性癡呆的病名，根據(jù)本病的常見臨床表現(xiàn)，應屬中醫(yī)“呆癡”“郁證”等范疇。祖國醫(yī)學認為AID的發(fā)生多與肝腎不足、腦髓不充，或飲食失宜，氣血虛弱，腦神失養(yǎng)有關(guān)；此外，中毒、外傷等損傷腦臟，遷延日久火邪、痰濁、瘀血阻塞清竅均可導致AD發(fā)生，出現(xiàn)失憶、失認失算、失斷(判斷)等臨床表現(xiàn)。

學習智能障礙是AD的主要癥狀。目前研究AD所用的模型大多為各種理化方法所致的學習記憶障礙模型。如M受體阻滯劑、蛋白質(zhì)或DNA合成抑制劑、缺氧、電損毀或化學損毀海馬、隔區(qū)等局部區(qū)域等。而本實驗采用實驗大鼠喂飼高TC飼料(1％膽固醇)，造成高TC血癥，進而使Aβ生成增多，出現(xiàn)學習記憶能力損傷、Aβ沉積等AD的特征樣改變的方法制作復合老年性癡呆的動物模型。高膽固醇致Aβ增高老年性癡呆大鼠模型目前在國外普遍使用^[3，4]，該方法造模簡便易行且有比較肯定的證據(jù)表明：高膽固醇能致Aβ增高產(chǎn)生擬衰老反應。故以喂飼高膽固醇方法復制的老年學習記憶障礙模型應是研究AD較為理想的模型之一。

大多數(shù)學者認為，AG在腦內(nèi)的異常沉積是AD發(fā)病較為初始的因素，在AD發(fā)病機制中具有關(guān)鍵作用^[5]。有關(guān)AD的發(fā)病機制，目前普遍認為是Aβ病因?qū)W說。Aβ由分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白產(chǎn)生。AD病人海馬區(qū)APP751水平2倍高于非AD海馬區(qū)的APP。APP功能和學習記憶密切相關(guān)，促進神經(jīng)細胞生長分化，增加神經(jīng)突觸的可塑性，及參與信號傳導，促進細胞黏附^[6]。而細胞內(nèi)膽固醇的含量對APP和Aβ代謝影響很大，在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運膽固醇(NPC)腦內(nèi)，由于神經(jīng)原纖維改變(AID的核心病變之一)，可能與膽固醇異常代謝有關(guān)。Aβ在腦內(nèi)異常凝集分子基礎(chǔ)可能與膽固醇參與促進可溶性AJ3的凝集的特異性。Aβ的形成依賴細胞內(nèi)膽固醇，膽固醇的代謝隨著年齡而改變，是AD以腦的老化為基礎(chǔ)而發(fā)病的分子機制，膽固醇在其中起關(guān)鍵性作用^[7]。針對Aβ纖維在AD發(fā)病中的關(guān)鍵作用，研究如何阻斷和延遲AD早期Aβ的積聚以及如何消除已形成的Aβ斑塊沉積為治療AD提供了切入點。

因此，根據(jù)老年性癡呆的發(fā)病特征及痰瘀阻竅、腎精虧虛這一原則，采用腦靈湯益腎健脾、活血化瘀、開竅滌痰，經(jīng)臨床驗證，該方在改善老年癡呆病人學習、記憶能力方面有顯著療效。本次實驗通過測定AD大鼠血清TC及腦內(nèi)Aβ、APP水平來探討腦靈湯治療AD的作用機制，結(jié)果顯示：經(jīng)該方治療后模型大鼠學習、記憶明顯改善；腦內(nèi)Aβ、APP含量明顯下降。該方和西藥相比，在降低血清TC及腦內(nèi)Aβ、APP含量方面明顯優(yōu)于西藥舒降之組(P＜0.05)。提示腑靈湯能夠降低AD大鼠血清總膽固醇水平、抑制APP的產(chǎn)生、減少腦組織Aβ含量從而改善大鼠的學習、記憶能力，對AD具有一定治療作用。

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作者簡介：裴異(1974—)，女，畢業(yè)于湖南中醫(yī)藥大學，主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，現(xiàn)工作于湖南省長沙市中心醫(yī)院(郵編：410003)；何明大，工作于中南大學湘雅附屬二醫(yī)院；黃孟軍，工作于廣西中醫(yī)學院研究生院。

(本文編輯 郭懷印)

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文”