摘要：目的探討肺心病痛人抗M₂、M₃受體自身抗體的產(chǎn)生、作用及其與右心結(jié)構(gòu)的關(guān)系。方法 用SA－ELISA法對108例肺心痛病人和30名健康人血清中抗M₂、M₃受體自身抗體進(jìn)行檢測，并與血氣分析及心臟超聲學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果肺心病組病人血清抗M₂、M₃受體自身抗體的陽性率及平均幾何滴度[48.15％，80(1.846±0.351)；40.74％，53(1.725±0.273)]均高于對照組[13.33％，40(1.602±0.369)；10.00％，20(1.301±0.000)](P＜<0.05)。對照組與肺心病組中M₂受體自身抗體陰性組、陽性組指標(biāo)比較及對照組與肺心病組中M₃受體自身抗體陰性組、陽性組指標(biāo)比較均表現(xiàn)為：血氧分壓(PaCO₂)呈逐漸降低趨勢，二氧化碳分壓(PaCO₂)右室流出道內(nèi)徑、右室內(nèi)徑呈逐漸增高趨勢(P＜0.05)。肺心病病人M₃受體自身抗體單陽性組，M₂受體自身抗體單陽性組，M₂、M₃受體自身抗體雙陽性組在心臟指標(biāo)方面，3組呈逐漸增高趨勢(P＜0.05)。結(jié)論M₂、M₃受體自身抗體可能與肺心病的發(fā)病過程密切相關(guān)；M₂、M₃受體自身抗體可能與肺心病發(fā)病過程中的心臟損害有關(guān)；M₂受體自身抗體在肺心病發(fā)病過程中可能起著較M₃受體自身抗體更為主要的作用，兩者在心臟形態(tài)學(xué)改變過程中可能起著協(xié)同作用。

關(guān)鍵詞：肺心?。籑2受體自身抗體；M₃受體自身抗體

中圖分類號：R541.5 R256.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1672—1349(2007)04—0295—03

長期以來慢性肺源性心臟病(簡稱肺心病)研究主要集中在缺氧導(dǎo)致肺動脈高壓引起肺心病這一主要機(jī)制上。但近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)肺心病病人僅為輕中度肺動脈高壓^[1，2]。單純的肺動脈壓力增高并不能完全解釋慢性肺心病的發(fā)病機(jī)制。因此，推測可能還有其他因素參與肺心病的發(fā)病。有實驗證明，肺心病在慢性發(fā)病過程中，伴有免疫系統(tǒng)紊亂，免疫細(xì)胞活性增高，免疫球蛋白含量增加^[3]。提示免疫因素可能參與了肺心病的發(fā)生發(fā)展。目前研究已經(jīng)證實心臟存在M₂、M₃受體。在肺心病大鼠模型中M₂受體自身抗體的陽性率和滴度明顯增高，且與大鼠左右心室病理改變高度相關(guān)。前期實驗證實缺氧肺心病大鼠模型中抗M₃受體自身抗體陽性率和滴度增高。這些都提示在肺心病病人出現(xiàn)右心衰竭的發(fā)病過程中可能也有心臟受體抗體的免疫學(xué)機(jī)制參與，尤其可能有M₂、M₃受體自身抗體的參與。因此，研究肺心病病人抗M₂、M₃受體自身抗體的產(chǎn)生、作用及其與右心結(jié)構(gòu)的關(guān)系，為進(jìn)一步探討肺心病發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2005年4月—2006年11月我院住院及門診的肺心病病人108例，所有入選病例均采用第二次全國肺心病專業(yè)會議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)^[4]，明確診斷為慢性阻塞性肺疾病(COPD)所致肺心病急性發(fā)作期的肺心病病人；同時選取我院門診體檢健康人30名作為對照。所有人選者均記錄病史、體格檢查，并進(jìn)行血氣分析、心臟超聲學(xué)檢查。所有入選者均排除自身免疫性疾病及其他心臟疾病，近1個月未用免疫抑制劑治療。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集所有受檢者均于采血前12 h禁食，于清晨07：00～08：00抽取5 mL靜脈血，靜置，經(jīng)4℃3000 r/min離心20 min，收集上清液(血清)，放人－70℃冰箱保存待測。

1.2.2 抗原肽段的合成 M₃受體抗原肽段的合成：按照人M₂－膽堿能受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段序列(169～193位氨基酸殘，V－R－T－V－E－D－G－E－C－Y－I－Q－F－F－S－N－A－A－V－T－F－G－T－A－I－C)，由武漢生物化學(xué)研究所合成。M₃受體抗原肽段的合成：按照人M₃－膽堿能受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段序列(18～36位氨基酸殘，S－S－W－I－H－S－P－D－G－L－P－P－G－T－V－T－H)，由西安美聯(lián)生物科技有限公司合成。

1.2.3 鏈親和素一酶聯(lián)免疫吸附實驗(SA－ELISA) ①包被抗原：將合成的M₂、M₃受體特異性抗原多肽配成濃度為5μL/mL的抗原包被液，包被空白ELISA反應(yīng)板，4℃冰箱過夜。②封閉ELISA板：用含有5％小牛血清的磷酸鹽緩沖液(1％PBS溶液，0.1％Tween20和5％小牛血清，pH 7.4，PMT)封閉ELISA板，37℃水浴1 h。③稀釋血清：將待測血清從1:20的濃度起倍比稀釋于PMT溶液中，加樣于ELISA板，37℃水浴1h。④加標(biāo)記有生物素的二抗：將生物素化羊抗人IgG單克隆抗體，按1:1000的濃度稀釋于PMT溶液中，加樣于ELISA板，37℃水浴1 h。⑤加標(biāo)記有辣根過氧化酶的鏈親和素將：SA－HRP以1:1000的濃度稀釋于PMT溶液中，加樣于ELISA板，37℃水浴1 h。⑥加底物：將底物(ABTS)按2 nmol/L的濃度溶于pH5.O的磷酸-枸櫞酸底物緩沖液中，臨加樣前加入H₂O₂(2.5 mmol/L)，37℃水浴30 min，待反應(yīng)穩(wěn)定后測定光密度值。⑦測定光密度值(OD)：用酶標(biāo)儀于λ＝405nm處測定各孔的光密度值。以上步驟每孔加樣50μL，①～⑤每步終了時用PBS－T溶液洗滌3次，每次5 min。

1.2.4 結(jié)果判定①抗體定性判定：P/N=(標(biāo)本OD值－空白OD值)／(陰性O(shè)D值－空白OD值)，以P／N值≥2.1為陽性。②抗體效價判定：將血清標(biāo)本從1:20起連續(xù)倍比稀釋，以出現(xiàn)P/N值≥2.1的最高稀釋度作為該標(biāo)本的效價。

1.2.5 心臟超聲心動圖檢查 SSH－140A彩色心臟超聲心動圖檢查儀(日本，東芝)。觀察指標(biāo)為：右室流出道內(nèi)徑、右室內(nèi)徑。

1.2.6 血氣分析AVL－995全自動血氣分析儀(瑞典產(chǎn))。觀察指標(biāo)為：動脈血氧分壓(PaO₂)、二氧化碳分壓(PaCO₂)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

描述，抗體滴度以幾何均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

表示，計數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)描述。兩組間比較采用T檢驗或X²檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及SNK－q檢驗或秩和檢驗。用SPSS 11.5軟件處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組M₂、M₃受體自身抗體陽性率及抗體滴度測定結(jié)果肺心病組病人血清M₂受體的自身抗體的陽性率及抗體滴度[48.15％，80(1.846±0.351)]均高于對照組[13.33％，40(1.602±0.369)]，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。肺心病組病人血清M₃受體的自身抗體的陽性率及抗體滴度[40.74％，53(1.725±0.273)]均高于對照組[10.00％，20(1.301±0.000)]，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 肺心病組中M₂受體自身抗體陽性組、陰性組與對照組指標(biāo)的比較3組在年齡、性別、體重指數(shù)等方面無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。對照組、M₂受體自身抗體陰性組、M₂受體自身抗體陽性組3組比較PaO₂(92.807 mmHg±4.035 mmHg、61.461mmHg±13.897 mmHg、47.539 mmHg±13.879 mmHg)呈逐漸降低趨勢，PaCO₂(39.377 mmHg±3。477 mmHg、50.689 mmHg±7.495mmHg、59.865mmHg±10.483mmHg)、右室流出道內(nèi)徑(25.067 mm±2.840 mm、32.714 mm±2.537 mm、36.615±2.499 mm)、右室內(nèi)徑(18.700 mm±2.879 mm、24.107 mm±2.973 mm、呈逐漸增高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 肺心病組中M₃受體自身抗體陽性組、陰性組與對照組指標(biāo)的比較 3組在年齡、性別、體重指數(shù)等方面無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。對照組、M₃受體自身抗體陰性組、M₃受體自身抗體陽性組3組比較PaO₂[(92.807±4.035)mmHg、(61.358±14.170)mmHg、(46.118±12.752)mmHg]呈逐漸降低趨勢，PaCO₂[(39.377±3.477)mmHg、(51.481±9.937)mmHg、(60.382±7.884)mmHg]、右室流出道內(nèi)徑[(25.067±2.840)mm、(33.688±2.693)mm、(35.909±3.421)mm]、右室內(nèi)徑[(18.700±2.879)mm、(24.813±2.705)mm、(26.546±2.956)mm]呈逐漸增高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 肺心病病人M₃受體自身抗體單陽性組、M₂受體自身抗體單陽性組、M₂、M₃受體自身抗體雙陽性組指標(biāo)的比較3組在年齡、性別、體重指數(shù)、PaO₂、PaCO₂方面無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在右室流出道內(nèi)徑[(31.857±1.345)mm、(35.000±2.000)mm、(37.800±2.178)mm]、右室內(nèi)徑[(23.571±2.637)mm、(25.818±1.251)mm、(27.933±1.907)mm]呈逐漸增高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

隨著近年來對心臟M受體(毒蕈堿乙酰膽堿能受體)各亞型認(rèn)識的逐漸加深，M受體在心臟功能調(diào)節(jié)方面作用的研究日益受到重視。M受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體，通過與不同的鳥苷酸調(diào)節(jié)蛋白(G蛋白)結(jié)合，引起不同的生理生化效應(yīng)。有研究顯示在某些病理條件下，血清抗M受體抗體的產(chǎn)生與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)^[5]。

Magnusson等^[6]與Fu等^[7]相繼發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)張性心肌病(DCM)病人血清中存在M₂受體的自身抗體，提出可能與心肌病的發(fā)病有關(guān)。此后，M₂受體自身抗體相繼在高血壓性心肌病、風(fēng)濕性心肌病、缺血性心臟病等多種心臟疾病中發(fā)現(xiàn)，且抗體滴度明顯高于正常人^[8，9]。本研究結(jié)果顯示，肺心病病人血清M₂受體的自身抗體的陽性率及抗體滴度(48.15％，80)明顯高于對照組(13.33％，40)(P＜0.05)。證實M2受體自身抗體的產(chǎn)生可能與肺心病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。進(jìn)一步分析肺心病病人M₂受體自身抗體陽性組與陰性組的臨床資料，結(jié)果顯示：M₂受體陽身抗體陽性組病人的動脈PaCO₂較低，動脈血PaCO₂較高。而右室流出道內(nèi)徑、右室內(nèi)徑及左室內(nèi)徑均增大，與陰性組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表明M₂受體自身抗體的產(chǎn)：生與肺心病心臟形態(tài)學(xué)改變密切相關(guān)。慢性肺心病病人的急性發(fā)作多并發(fā)呼吸衰竭、心力衰竭，使得機(jī)體長期或反復(fù)處于高碳酸血癥和缺氧狀態(tài)，可能誘發(fā)了心臟M₂受體自身抗體的產(chǎn)生。而自身抗體反過來又通過影響受體功能而加劇心臟病理變化和功能失調(diào)^[8，10]。因此在肺心病出現(xiàn)右心衰竭的發(fā)病過程中可能也有心臟受體抗體的免疫學(xué)機(jī)制參與。

Hellengen應(yīng)用放射自顯影技術(shù)首次證明心臟上還存在M₃受體，此后又闡明了M₃受體是通過磷脂酶C(PLC)途徑發(fā)揮作用的^[11]。馬滿玲等^[12]從膽堿對大鼠和家兔心臟M₃受體作用實驗研究中也證實心肌上存在M₃受體。研究顯示在各種心臟疾病病理過程中都伴有氧化應(yīng)激反應(yīng)^[13]。心肌在缺氧情況下可產(chǎn)生氧自由基，大量氧自由基可引起心肌組織的嚴(yán)重?fù)p傷。李麗等^[14]以外源性H₂O₂誘導(dǎo)大鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞損傷模型為基礎(chǔ)，給予M₃受體激動劑膽堿和M3受體阻斷劑4DAMP進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示：M₃受體激動對H₂O₂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。Yang等^[15]研究發(fā)現(xiàn)，激動心肌M₃受體可激活Bcl－2和ERK等抗凋亡信號分子，并抑制凋亡前體蛋白Fas和p38MAPK的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)Ca^2＋超載，從而發(fā)揮對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺心病病人的血清中存在M₃受體自身抗體，其陽性率和抗體滴度(40.74％，53)均高于對照組[(10.00％，20)，P＜O.05]。提示M₃受體自身抗體可能與肺心病的發(fā)病有關(guān)。進(jìn)一步分析肺心病組中M₃受體自身抗體陽性組與陰性組臨床資料顯示：M₃受體自身抗體陽性組病人的PaCO₂較低，PaCO₂較高。而右室流出道內(nèi)徑、右室內(nèi)徑及左室內(nèi)徑均增大．與陰性組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。進(jìn)一步提示M₃受體自身抗體可能也與肺心病心臟形態(tài)學(xué)改變有關(guān)，推測肺心病病人M₃受體自身抗體表達(dá)增加，該抗體與M₃受體長期結(jié)合，可以降低M₃受體對乙酰膽堿的敏感性，從而抑制心肌細(xì)胞中的Bcl－2(凋亡抑制基因)蛋白表達(dá)，加速心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制了對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，同時還可以造成M₃受體的進(jìn)行性破壞，導(dǎo)致受體的降解，數(shù)量減少，以上可能是導(dǎo)致心功能從“代償”向“失代償”轉(zhuǎn)折的原因之一。

本研究結(jié)果顯示，M₂受體自身抗體與M₃受體自身抗體均可能與肺心病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，那么兩者的關(guān)系如何?故本研究又將肺心病病人分為M₃受體自身抗體單陽性組、M₂受體自身抗體單陽性組及M₂、M₃受體自身抗體雙陽性組，3組進(jìn)行比較顯示：M₂受體自身抗體單陽性組右室流出道內(nèi)徑、右室內(nèi)徑及左室內(nèi)徑明顯高于M₃受體自身抗體單陽性組，提示M₂受體自身抗體在肺心病病人心臟結(jié)構(gòu)變化過程中所起的作用較M₃受體自身抗體明顯；同時，M₂、M₃受體自身抗體雙陽性組心臟指標(biāo)較單陽性組明顯增高，表明兩者可能有協(xié)同作用。分析以上結(jié)果可能與心臟上M受體分布數(shù)量有關(guān)。有研究顯示，M受體各亞型在心房和心室表達(dá)水平各不相同，但從總量上看，心房和心室M受體表達(dá)水平無明顯差異。心臟上主要存在M2受體，M₃受體只占3％^[16]。

總之，M₂受體自身抗體與M₃受體自身抗體的產(chǎn)生可能參與了肺心病的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致心臟病理變化和功能失調(diào)，且兩者呈協(xié)同作用，其中M₂體自身抗體起著更為主要的作用，但兩者作用的具體機(jī)制及其二者的相互關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 羅慰慈．現(xiàn)代呼吸病學(xué)[M]．北京：人民軍醫(yī)出版社，1997：43—57．

[2] 張珍祥．慢性阻塞性肺疾病緩解期肺循環(huán)血流動力學(xué)的研究[J]．中華結(jié)核和呼吸雜志，1991，14：237．

[3] 胡覺文，王曉玲，宗文九．慢性肺心病患者的免疫功能與臨床觀察[J]．臨床內(nèi)科雜志，1994，11(2)：29—30

[4] 張珍祥．慢性肺源性心臟病[M]//葉任高，陸再英．內(nèi)科學(xué)．第6版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：86—91．

[5] Fu LX．Anti－M₂－muscarinic receptor autoantibodies and idiopathicdilated cardiomyopathy[J]．Int J Cardiol，1996，54：127—135．

[6] Magnusson Y，Marullo S，Hoyer s，et al．Mapping of a functional au-toimmune epitope on the β₁－adrenergic receptor in patients with idio-pathic dilated cardiomyopathy[J]．J Clin Invest，1990，86：1658．

[7] Fu LX，Yvonne M，Claes－Makan B，et al．Localization of afunction-al autoimmune eptiope on the muscarnic acetylcholine receptor－2 inpatients with idiopathic dilated cardiomyopathy[J]．J Clin Invest，1993．9：1964．

[8] 張麟，張健，陶貞寅，等．高血壓性心臟病抗G－蛋白偶聯(lián)β₁－腎上腺素能受體與M₂膽堿能受體自身抗體的初步研究[J]．高血壓雜志，1998，6(1)：5—7．

[9] Matsui s，F(xiàn)u LX，Shimizu M，et al．Dilated cardiomyopathy definesserum autoantibodies against G－protein－coupled cardiovascular re-ceptors[J]．Immnuol，1995，21：85—88．

[10] 李靜，胡大一，張麟，等．靶劑量比索洛爾治療慢性心力衰竭對心臟β₁，和M2受體自身抗體和心功能的影響[J]．中華心血管病雜志，2003，31(9)：665—669．

[11] Ponicke K，Heinroth—Hoffnmnn I，Brodde OE Demonstration offunctional M₃－muscarinic receptor in ventricular cardiomyocytes ofadult rats[J]．Br J Pharmacol，2003，138(1)：156—160．

[12] 馬滿玲，劉艷，王玲，等．膽堿對大鼠和家兔心臟M₃受體作用實驗研究[J]．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003，37(4)：302—304．

[13] Dhalla NS，Elmoselhi AB，Hata T，et al．Status of myocardial antiox-idants in ischemic－reperfusion injury[J]．Cardiorasc Res，2000，47(3)：446—456

[14] 李麗，劉艷，李呼論，等．M₃受體激動對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J]．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，38(5)：416—417．

[15] Yang BF，Lin HX，Xu CQ，et al．Improvement of control functionand promotion of cardiomyocyte survival inishemic hearts：Evidencefor the role of cardiac M₃ subtype muscarinic acetylcholine receptors[J]．Cell Physiol Biochem，2005，16：163—174．

[16] Krejci A，Tucek S．Quantitation of mRNKs for M(1)to M(5)sub-types of muscarinic receptors in rat heart and brain cortex[J]．MolPharmacol，2002，61(6)：1267—1272．

作者簡介：仲劍克(1970—)，男，現(xiàn)為山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院碩士研究生(郵編：030001)；劉學(xué)軍、祁琨，工作于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院。

(本文編輯 郭懷印)