摘要：目的觀察腦心通膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注腦組織病理變化及MMP－2、MMP－9表達(dá)的影響，并探討其可能的保護機制。方法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，應(yīng)用HE及S－P免疫組化法分別觀察模型組及用藥組大鼠全腦組織的病理改變及MMP－2、MMP－9表達(dá)的變化。結(jié)果假手術(shù)組大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，MMP－2、MMP－9見少量散在陽性表達(dá)或不表達(dá)；模型組大鼠大腦缺血再灌注區(qū)組織明顯水腫、蛻變、壞死伴少量炎細(xì)胞浸潤，對側(cè)大腦相應(yīng)區(qū)及雙側(cè)小腦輕度水腫，MMP－2、MMP－9表達(dá)較假手術(shù)組對應(yīng)區(qū)顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)，其中缺血側(cè)大腦以壞死區(qū)邊緣腦組織表達(dá)為甚，且較對側(cè)大腦及雙側(cè)小腦明顯升高(P＜0.05)；腦心通用藥組大鼠大腦缺血區(qū)組織水腫、蛻變、壞死較模型組明顯減輕，對側(cè)大腦相應(yīng)區(qū)及雙側(cè)小腦腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，MMP－2、MMP－9表達(dá)較模型組對應(yīng)區(qū)顯著降低(P＜0.05)。結(jié)論腦心通膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注后包括病灶在內(nèi)的全腦損傷有保護作用，其作用機制可能與降低MMP－2、MMI－9表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：腦缺血；再灌注；腦心通膠囊；免疫組織化學(xué)；大鼠

中圖分類號：R743.31 R285.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672一1349(2007)04—0328—03

腦缺血再灌注后可出現(xiàn)腦水腫，加重因缺血、缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷，并導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高、腦疝等并發(fā)癥，是中風(fēng)病人早期死亡的重要原因。再灌注損傷涉及到多方面的機制，近幾年研究發(fā)現(xiàn)^[1]，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)尤其是其中的明膠酶(MMP－2、MMP－9)表達(dá)的異常是腦缺血再灌注損傷的重要機制。臨床實踐表明腦心通在腦缺血再灌注損傷治療中有較好的療效，但其確切機制尚不明^[2]。鑒于此，本研究旨在建立大鼠腦缺血2 h再灌注24 h模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)后，通過觀察缺血再灌注組及腦心通用藥組大鼠腦組織的病理組織學(xué)改變及MMP－2、MMP－9表達(dá)的變化以探討腦心通在腦缺血再灌注損傷中的可能作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 取健康成年Sprague Dawley雄性大鼠45只，體重250 g～300 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(皖醫(yī)室動第0l號)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(23～25)℃，濕度60％～70％，自然光照，復(fù)合顆粒飼料，自由飲水。將大鼠隨機分成3組：假手術(shù)組(5只)、模型組(20只)、腦心通組(20只)。

1.2 試劑兔抗鼠MMP－2單抗、免抗鼠MMP－9單抗、S－PKit及DAB顯色試劑均購自北京中山生物技術(shù)有限公司(除S－P Kit為美國Zymed公司產(chǎn)品外，其余均系美國Santa－Cruz公司產(chǎn)品)。

1.3 動物模型制作參照Zcalonga等^[3]法，以10％的水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，頸部正中切口，逐層分離暴露右側(cè)頸總動脈，靠近心端結(jié)扎，遠(yuǎn)心端做切口置人2－0魚線(頭端加熱呈直徑約0.3 mm的圓球形)，插入約18 mm～20Hm(距頸總動脈分叉處)，魚線。逐層縫合切口，魚線殘端留置切口外約5 mm。再灌注時，將魚線拔出約10 mm。模型成功的標(biāo)志是術(shù)后動物出現(xiàn)同側(cè)Homers征及動物麻醉清醒后出現(xiàn)以左前肢為主的偏癱。給藥途徑：腦心通治療組給予腦心通藥液灌胃(2 g/kg；給藥容積0.5 mL/100 g，每天1次，連續(xù)5 d)，于第5天灌胃1 h后手術(shù)制備局灶腦缺血再灌注模型(同上述模型組)，假手術(shù)組與模型組給予等量的生理鹽水。再灌注24 h后，斷頭取腦，大腦、小腦均行冠狀切面取材，其中大腦在以視交叉為中心處冠狀切面取材。假手術(shù)組大鼠不作缺血處理，也不予藥物治療，取材部位同上。

1.4 病理形態(tài)學(xué) 上述取材腦標(biāo)本10％中性甲醛固定，石蠟包埋，5 um連續(xù)切片數(shù)張，其中1張行HE染色，其余作免疫組化檢測之用。

1.5 S－P免疫組織化學(xué)法組織切片先行煮沸抗原修復(fù)，具體操作按說明書進(jìn)行，一抗稀釋度為MMP－2(1:150)、MMP－9(1:120)，最后蘇木精復(fù)染。陽性對照為已知的MMP-2、MMP－9陽性切片；陰性對照為用PBS代替一抗。陽性信號為棕黃色。陽性計數(shù)：結(jié)合HE圖像相應(yīng)區(qū)，各組每只大鼠相應(yīng)部位均選1張切片，高倍鏡下取10個視野，數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)及陽性血管數(shù)，然后取各組平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

表示，各組間比較采用γ²檢驗及t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病理組織學(xué)改變 5只假手術(shù)組大鼠無1例死亡，40只造模大鼠中除模型組死亡3例，用藥組死亡2例外，其余均成功。HE染色后，假手術(shù)組大鼠大、小腦組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠右側(cè)大腦缺血區(qū)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少，殘存神經(jīng)元固縮蛻變，間質(zhì)高度水腫，少量炎細(xì)胞浸潤，缺血邊緣區(qū)腦組織明顯水腫，見少量格子細(xì)胞。左側(cè)大腦對應(yīng)區(qū)及雙側(cè)小腦呈較輕的水腫改變。腦心通用藥組大鼠右側(cè)大腦缺血區(qū)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞蛻變、間質(zhì)水腫及炎細(xì)胞浸潤較模型組明顯減輕，左側(cè)大腦對應(yīng)區(qū)及雙側(cè)小腦未見明顯異常。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果(見表1) 在假手術(shù)組大鼠的雙側(cè)大小腦組織MMP－2、MMP－9見少量散在陽性表達(dá)或不表達(dá)，其中MMP－2陽性表達(dá)略高，陽性定位主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)、胞膜中。模型組大鼠雙側(cè)大小腦組織MMP－2、MMP－9表達(dá)較假手術(shù)組對應(yīng)區(qū)域顯著升高。其中缺血側(cè)大腦又較對側(cè)大腦及雙側(cè)小腦明顯升高(P＜0.05)。陽性表達(dá)除定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)、胞膜外，也見于神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞及炎細(xì)胞。從組織水平分布上，缺血側(cè)大腦組織以壞死蛻變區(qū)的邊緣腦組織陽性表達(dá)為甚，對側(cè)大腦則呈較均勻的散在陽性表達(dá)，雙側(cè)小腦中均以Ⅳ腦室附近白質(zhì)的微小血管表達(dá)較明顯，其次是小腦皮質(zhì)神經(jīng)元。腦心通組大鼠雙側(cè)大小腦組織MMP－2、MMP－9表達(dá)較模型組對應(yīng)區(qū)域顯著降低。

3 討 論

現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)認(rèn)為^[4]，神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的相互依存關(guān)系是組成和維持腦功能及結(jié)構(gòu)的必要條件，血腦屏障參與血腦物質(zhì)交換的調(diào)節(jié)，而神經(jīng)元的直接生存微環(huán)境是神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞間的細(xì)胞間液即細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。腦組織中ECM是維持血腦屏障(BBB)結(jié)構(gòu)完整性的重要組成部分，其中基底膜尤為重要，它由ECM分子如Ⅳ型膠原、層黏蛋白和纖維連接蛋白構(gòu)成，為血管的完整性提供結(jié)構(gòu)支持^[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶是一組含鋅酶的基因家族，其家族中的明膠酶即MMP－2(明膠酶A)和MMP－9(明膠酶B)有一個纖黏蛋白結(jié)合域，可降解ECM、破壞腦血管外基底膜主要成分(黏蛋白和纖黏蛋白)從而破壞血腦屏障、改變毛細(xì)血管通透性導(dǎo)致血管源性腦水腫甚至出血性轉(zhuǎn)化。

本實驗中，首先病理形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果顯示假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常；缺血再灌模型組大鼠缺血區(qū)腦組織明顯水腫、退變壞死，說明造模成功。其次，MMP－2、MMP－9在假手術(shù)組不表達(dá)或僅少量陽性表達(dá)，與文獻(xiàn)報道基本一致^[6，7]。而模型組大鼠腦組織MMP－2、MMP－9表達(dá)均較假手術(shù)組對應(yīng)區(qū)域顯著升高，其中尤以缺血側(cè)大腦為甚；此與Rosenberg等^[8]用細(xì)胞培養(yǎng)及免疫組化檢測的結(jié)果基本一致。這表明MMP－2、MMP－9在缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用，結(jié)合模型組大鼠腦組織較假手術(shù)組呈明顯水腫改變及MMP－2、MMP－9本身生物學(xué)功能，提示MMP－2、MMP－9參與損傷的部分機制是通過降解ECM尤其血管基底膜、破壞血腦屏障、引起血管源性腦水腫。新近國外有文獻(xiàn)^[9]報道，在MCAO腦缺血再灌注損傷中檢測到MMP－2、MMP－9明顯升高的同時伴有Ⅳ型膠原、層剩蛋白等ECM含量的下降，這為上述推論提供了證據(jù)。

本研究顯示，腦心通治療組大鼠缺血再灌注后其組織學(xué)損傷較模型組明顯減輕，這說明腦心通對大鼠缺血再灌注后腦損傷有保護作用。與此同時，相應(yīng)的MMP－2、MMP－9表達(dá)也較模型組顯著降低則進(jìn)一步提示腦心通可能通過下調(diào)MMP－2 MMP－9表達(dá)這一機制來對抗缺血再灌注損傷而發(fā)揮其保護作用的。而要完全證實則有待于進(jìn)一步檢測血腦屏障中Ⅳ型膠原、層黏蛋白和纖維連接蛋白等ECM的變化。

近幾年臨床和動物實驗的研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死急性期，除病灶側(cè)外，在遠(yuǎn)離病灶的部位也出現(xiàn)血流及代謝的改變，臨床上則表現(xiàn)為各種不同類型的神經(jīng)機能聯(lián)系不能，其形成機制目前認(rèn)為可能與血流動力學(xué)改變及神經(jīng)傳導(dǎo)通路的抑制有關(guān)，但具體確切機制尚不明。Lzumi等^[10]采用MCAO模型動態(tài)觀察大腦中動脈阻塞后3 h、6 h、9 h和24 h冠狀位大腦MRI的信號，發(fā)現(xiàn)MRI異常信號的出現(xiàn)除分布在MCA供血區(qū)外，還涉及同側(cè)大腦半球MCA供血區(qū)之外的海馬、梨狀葉以及對側(cè)大腦半球，并提示遠(yuǎn)隔部位異常信號為水腫。這表明MCAO模型可用于研究神經(jīng)機能聯(lián)系不能且腦水腫可能是其病理變化之一。Heo等^[11]曾對27例非人類靈長類動物MCA缺血再灌注后，缺血區(qū)及非缺血區(qū)基底核進(jìn)行了冰凍組織切片和血漿標(biāo)本MMP－2、MMP－9的檢測，結(jié)果顯示二者均有局部表達(dá)及血漿水平的升高。本實驗結(jié)果顯示模型組大鼠非缺血側(cè)腦組織較假手術(shù)組有輕度水腫，且MMP－2、MMP－9表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，與上述Heo等^[11]結(jié)果較一致，進(jìn)一步提示MMP－2、MMP－9可能是通過引起腦水腫參與了局灶性腦梗死繼發(fā)全腦損害的形成機制，繼而臨床上表現(xiàn)出神經(jīng)機能聯(lián)系不能。腦心通治療組大鼠非缺血側(cè)腦組織的組織學(xué)改變及MMP－2、MMP－9表達(dá)則與假手術(shù)組無差異，這表明腦心通可通過抑制遠(yuǎn)隔部位腦組織MMP－2、MMP－9過度表達(dá)減輕遠(yuǎn)隔部位腦水腫進(jìn)而減輕神經(jīng)機能聯(lián)系不能。

腦心通通過抑制腦組織MMP－2、MMP－9的表達(dá)不僅可減輕病灶組織的腦缺血再灌注損傷而且可減輕遠(yuǎn)隔部位腦水腫，表明腦心通治療作用之外尚存在全腦的保護作用。

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作者簡介：余鋒，現(xiàn)工作于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院(郵編：230001)：胡向陽、董六一，工作于安徽醫(yī)科大學(xué)；王文靜、李淮玉、任明山，工作于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院。

(本文編輯 郭懷印)

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文”