摘要：目的觀察硝酸甘油(GTN)誘導的大鼠偏頭痛模型中大鼠三叉神經(jīng)核尾部(TNC)C－fos蛋白的表達，以及氟桂利嗪(西比靈)對其表達的影響。方法 將24只Wistar大鼠隨機分為4組，即假手術組、對照組、西比靈治療組、西比靈預防組，用硝酸甘油10 mg/kg劑量皮下注射復制偏頭痛模型，用免疫組化SP法觀察C－fos蛋白表達的陽性細胞數(shù)、面積及灰度，并進行組間比較。結(jié)果對照組中三叉神經(jīng)核尾部表達c－fos蛋白陽性細胞數(shù)較其余3組明顯增多。對照組C-fos蛋白陽性細胞數(shù)與假手術組及西比靈治療組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，但西比靈治療組、西比靈預防組與假手術組之間無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 西比靈治療組和預防組均能顯著抑制C－fos蛋白的表達，其作用機制，可能是干預C－fos蛋白產(chǎn)生的某個環(huán)節(jié)，說明西比靈在治療和預防偏頭痛的發(fā)作過程中均起一定的作用。

關鍵詞：偏頭痛；西比靈；三叉神經(jīng)核尾部；硝酸甘油

中圖分類號：R747.2 R255 文獻標識碼：A 文章編號：1672—1349(2007)04—0322—02

偏頭痛是臨床上常見的多發(fā)性疾病，世界衛(wèi)生組織近來將偏頭痛歸類于20類致殘性最強的慢性疾病之一^[1]。大部分病人選用單一或聯(lián)合用藥來終止頭痛的發(fā)作，效果都不理想^[2]。本實驗通過觀察由硝酸甘油(GTN)誘導的偏頭痛模型中大鼠三叉神經(jīng)核尾部(TNC)的C－fos蛋白的表達，以及氟桂利嗪(西比靈)對其表達的影響，以探討偏頭痛的發(fā)病機制及其藥物干預的效果，為臨床治療偏頭痛提供有效的藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar系健康封閉群大鼠24只，體重(220～250)g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及藥品兔抗大鼠C－fos抗體(博士德生物工程有限公司)，SP－9001免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)，西比靈(西安楊森制藥有限公司，批號041103779)，硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司，批號20050909)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及造模將24只大鼠隨機分為為假手術組、對照組、西比靈治療組、西比靈預防組，每組6只。假手術組大鼠皮下注射生理鹽水1.04 mL/kg；對照組、西比靈治療組和西比靈預防組大鼠皮下注射硝酸甘油注射劑10 mg/kg，建立實驗性偏頭痛模型，以出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)增多等提示模型動物頭部不適的癥狀為造模成功的指標。對照組造模30 min后灌胃蒸餾水1.04 mL/kg；西比靈治療組造模(15～20)min后灌胃西比靈1.04 mg/kg；西比靈預防組建立模型前灌胃西比靈1.04 mg/kg 1周。

1.3.2 灌注、固定、取材及切片造模4 h后，用1％戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉動物，仰臥固定，開胸，左心室插管入主動脈，剪開下腔靜脈。首先迅速灌注無菌生理鹽水200 mL。取大鼠腦組織，由延髓閂部向尾端行冠狀切取4 mm腦組織，放入甲醛液中固定24 h，后移入70％的乙醇中保存。常規(guī)脫水、石蠟包埋。石蠟切片機切片，4um 1張，共4張。

1.3.3 免疫組化石蠟切片行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察確定組織結(jié)構(gòu)未被破壞，進行免疫組織化學染色。室溫顯色，鏡下控制反應時間，(2～3)min后顯色充分。蒸餾水充分洗滌。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.4

免疫組化對照實驗陰性對照：用PBS代替C－fos抗體，其他步驟與前述程序相同。

1.3.5

圖像定量分析在光學顯微鏡下，切片背景為淡黃或無色，陽性細胞呈黃棕色，多為圓形或卵圓形。采用病理圖像分析系統(tǒng)通過光學顯微鏡攝取圖像，輸入圖像分析系統(tǒng)內(nèi)。對每張切片在TNC的部位隨機選取5個視野的數(shù)據(jù)。取其平均值進行比較。

1.4 統(tǒng)計學處理所有實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差

表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，各組間比較用方差分析，其中兩兩比較用q檢驗。P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

各組中C－fos蛋白陽性細胞為棕黃色染色。C－fos陽性細胞主要分布在兩側(cè)的TNC。陰性對照片無陽性信號出現(xiàn)，對照組中TNC的C－fos蛋白陽性細胞數(shù)較其余3組明顯增多。對照組與假手術組及西比靈治療組間比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，西比靈治療組與假手術組、西比靈預防組與假手術組之間無統(tǒng)計學意義。詳見表1。

3 討 論

分布在皮膚、肌肉、關節(jié)和內(nèi)臟器官中的傷害性感受器對傷害性刺激(初級感覺神經(jīng)元的外周部分)如傷害性熱、強烈機械刺激和化學刺激均產(chǎn)生反應，刺激信息沿Aδ和C類纖維傳入背根神經(jīng)節(jié)和TNC的神經(jīng)元中，背根神經(jīng)節(jié)和TNC的神經(jīng)元將傷害性刺激的信息轉(zhuǎn)化成神經(jīng)沖動(電活動)，經(jīng)脊髓、腦干和丘腦的傳遞和調(diào)制，最后在大腦皮質(zhì)產(chǎn)生痛覺。偏頭痛的發(fā)病機制就可能為某些傷害性刺激沿該途徑傳遞至腦干引起三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)痛覺敏感性增強而引發(fā)頭痛。

目前對引發(fā)偏頭痛發(fā)作的神經(jīng)元解剖定位和其病理生理過程還不清楚，多數(shù)學者認為偏頭痛的發(fā)病機制是外周傷害性刺激激活中樞和外周的三又神經(jīng)血管系統(tǒng)引發(fā)頭痛發(fā)作^[3]。由此可見三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)在偏頭痛的發(fā)生中起著非常重要的作用，化學或單側(cè)電刺激三叉神經(jīng)節(jié)(UETGS^[4]或注射GTN后，分布在硬腦膜、結(jié)膜、眼瞼和口周的TNC末梢纖維釋放血管活性肽，如P物質(zhì)(SP)、神經(jīng)激肽A(NKA)和降鈣素基因相關肽(CGRP)。這些物質(zhì)引起了血管內(nèi)皮形成微絨毛和空泡(特別在硬腦膜靜脈后部毛細血管里)，肥大細胞脫顆粒、血小板集聚造成血管擴張和組織中的血漿蛋白外滲，激活自主神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)結(jié)膜充血、流淚、流涕、惡心和嘔吐等癥狀。

本實驗采用硝酸甘油模型，通過導致腦膜血管擴張、神經(jīng)源性炎癥形成及激活下丘腦、腦干及脊髓節(jié)段神經(jīng)元功能等作用，引起二又神經(jīng)纖維超敏既誘發(fā)頭痛^[5]。

GTN在血液內(nèi)半衰期較短約(1～4)min。皮下注射GTN后，GTN在體內(nèi)首先轉(zhuǎn)化為一氧化氮(NO)。NO是一種強力的內(nèi)源性血管擴張劑和一種新型的逆行神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。NO作用于血管周圍的一氧化氮能神經(jīng)纖維(NO－ergic fiber)，產(chǎn)生神經(jīng)源性血管擴張。NO還參與傷害性刺激的產(chǎn)生與傳遞，被認為是傳遞外周傷害性刺激的逆行性神經(jīng)遞質(zhì)^[6]。有研究表明NO對傷害性感受器有直接作用，體外單纖維記錄表明，皮膚感受野的灌流液中增加NO含量，引起傷害性感受器的發(fā)放，誘導感受器對機械性刺激的敏感性。傷害性刺激同時也能引起脊髓背角神經(jīng)元釋放NO，注射GTN后，三叉神經(jīng)核尾部NOS神經(jīng)元的活性增加^[7]，使體內(nèi)NO形成增多。

同Offenhauser等^[8]的實驗結(jié)論一致，本組實驗中，觀察到在注射GTN 4 h后，TNC的神經(jīng)元表達C－fos蛋白，對照組與假手術組、西比靈治療組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，西比靈治療組、兩比靈預防組與假手術組之間無統(tǒng)計學意義。西比靈減少TNC的C－fos表達可能為其能夠緩解頭痛的機制之一。

本實驗中，西比靈治療組、西比靈預防組和對照組在3 min左右出現(xiàn)前肢頻繁撓頭、爬籠。前肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)在(30～60)min，3組比較無明顯的差別，在1 h后西比靈預防組、西比靈治療組和模型組比較，大鼠前肢頻繁撓頭，爬籠次數(shù)減少。說明兩比靈不能減輕由NO引起的血管擴張。Ciancarelli等^[9]實驗結(jié)果也說明西比靈不能防止NO介導的血管舒張。西比靈治療偏頭痛可能有多種作用途徑。

西比靈是新型的長效非選擇性的T型、N型、L型鈣通道阻滯劑^{[10，11]}。西比靈治療偏頭痛作用機制在于阻斷細胞膜和神經(jīng)纖維上的鈣通道，抑制Ca²⁺內(nèi)流使處于痙攣期的血管擴張，改善腦部供血供氧，用于治療偏頭痛。腦部單光子發(fā)射斷層顯像(SPECT)和磁共振成像(MRI)均顯示普通偏頭痛病人左側(cè)額葉、頂葉、枕葉部和右側(cè)枕部的血灌注量下降^[12，13]。經(jīng)過西比靈治療后，大腦中動脈、大腦前動脈的收縮期峰值流速減慢，血管擴張，減少偏頭痛的發(fā)作次數(shù)和頭痛程度^[14]。實驗證明西比靈可能是通過阻斷脊髓背角第1層、第Ⅱ?qū)覰型Ca²通道和抑制NMDA受體的激活，增強神經(jīng)元細胞膜的穩(wěn)定性，減少TNC神經(jīng)元對外界的傷害性刺激敏感性及減少NO的合成，發(fā)揮防治偏頭痛的作用。

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作者簡介：郝嘉楠(1980—)，男，畢業(yè)于山西醫(yī)科大學大同學院，現(xiàn)為山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科在讀碩士研究生(郵編：030001)；牛爭平，工作于山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院。

(本文編輯 郭懷印)

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文”