【摘要】目的本課題通過小鼠視網(wǎng)膜新生血管動物模型觀察玻璃體內(nèi)注入色素上皮衍生因子（PEDF）對視網(wǎng)膜新生血管形成的影響，并探討其治療作用。方法選取鼠齡為7天的健康昆明小鼠28只（56只眼），隨機分為4組：正常組、高氧組、PEDF干預(yù)組和對照生理鹽水組，每組7只。正常對照組鼠在正?？諝猸h(huán)境中飼養(yǎng)，其余3組鼠置于氧箱中，建立高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管動物模型。正常組鼠不做任何處理，PEDF干預(yù)組幼鼠在出生后第12天向玻璃體腔內(nèi)注射PEDF 1 μl，而對照生理鹽水組注射相同體積的生理鹽水。各組小鼠均在出生后第17天處死，摘除眼球制作標本，進行組織病理學(xué)觀察。在光學(xué)顯微鏡下觀察并計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞細胞核數(shù)目。采用CD31分子免疫組化方法鑒別視網(wǎng)膜內(nèi)界膜與血管內(nèi)皮細胞。結(jié)果正常對照組標本HE染色未見突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細胞核，高氧組和對照生理鹽水組標本可見較多的突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細胞核，與正常組比較差異具有顯著性(P<0.05)，PEDF干預(yù)組的數(shù)目明顯少于高氧組和對照生理鹽水組，差異均具有顯著性(P<0.05)，且未見明顯藥物毒性反應(yīng)。CD31分子免疫組化染色證實突破內(nèi)界膜的細胞為血管內(nèi)皮細胞。結(jié)論玻璃體內(nèi)注入一定劑量的PEDF，能夠有效抑制高氧誘導(dǎo)下的小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成，PEDF有望成為防治血管增生性視網(wǎng)膜病變的一種有效的方法。

【關(guān)鍵詞】視網(wǎng)膜新生血管；色素上皮衍生因子（PEDF）；血管生成抑制劑

文章編號：1003-1383(2006)03-0227-04

中圖分類號：R 339.146文獻標識碼：A

study on effect of pigment epithelialderived factor in the protection for retinal neovascularization in mice 

SUN Qingxiu1，NING Jianhong1，MENG Ruihua2

(1.Department of Ophthalmology，the 2nd Affiliated Hospital of Qingdao

University，Qingdao，Shandong，266000，China; 2.Department of phthalmology，the Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao，Shandong，266000，China)

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【Abstract】ObjectiveTo study the effect and the therapeutically role of pigment epithelialderived factor (PEDF) in the protection for retinal neovascularization in mice.Methods①Twentyeight oneweekold Kunming mice were randomly divided into four groups: normal group， hyperxia group， PEDF group and 0.9%NaCl injected control group. The normal group was fed in the normal environment. The other groups were exposed to 75% oxygen to establish a model of retinal neovascularization. Mice in normal group did not receive any treatment. Mice in PEDF group were given an intravitreal injection of 1μl of PEDF and the same volume of 0.9%NaCl was injected into 0.9%NaCl group mice as a control. ②All mice were killed in 17day old. The eyes were enucleated for histological examination. ③the number of nuclei of endothelial cell extending from retinal internal limiting membrane was counted by optics microscope .the endothelial cell and retinal internal limiting membrane were identified by CD31 Immunocytochemical method .Resultsno nuclei of endothelial cell extending from retinal internal limiting membrane was found in normal group， while some were found in hyperxia group and 0.9%NaCl injected control group. there was significant difference between them (P<0.05). But less nuclei were found in the PEDF group .there was significant difference between them(P<0.05).and no side effect was found. the cells extending from retinal internal limiting membrane were confirm to be endothelial cell by CD31 Immunocytochemical method. ConclusionIntravitreal injection of PEDF may suppress the retinal neovascularization in the mice oxygen model which suggests that intravitreal injection of PEDF may have potential therapeutic benefits in retinal vascular disease.

【Key words】retinal neovascularization；pigment epithelialderived factor (PEDF)；hypertrophic scar

視網(wǎng)膜新生血管性疾病是人類致盲的重要原因，研究如何控制新生血管的發(fā)生以及使已經(jīng)形成的新生血管退化，對治療這些疾病有重要意義。目前對新生血管性疾病主要采用激光和手術(shù)治療，雖然有效，但復(fù)發(fā)和一定程度的視功能損害一直是人們所困擾的問題，人們正期待著從分子生物學(xué)

作者簡介：孫清秀(1971-)，女，山東省榮成縣人，眼科主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。水平做進一步深入研究，期盼早日找到阻斷新生血管產(chǎn)生及活性的藥物。色素上皮衍生因子(PEDF)是一種內(nèi)源性細胞因子，最先從人的色素上皮細胞調(diào)理液中提純出來的^[1]，具有保護神經(jīng)視網(wǎng)膜，特別是光感受器的重要生理作用。Dawson等^[2]1999年首次發(fā)現(xiàn)PEDF還具有抑制血管增生的作用。國外學(xué)者對此進行了較多的研究，而國內(nèi)學(xué)者關(guān)于PEDF對視網(wǎng)膜新生血管的作用報道較少。本文就PEDF和視網(wǎng)膜新生血管的關(guān)系作一研究，通過相對缺氧的辦法建立視網(wǎng)膜新生血管病變小鼠模型，并在其玻璃體腔內(nèi)注射一定劑量的PEDF，觀察PEDF對視網(wǎng)膜新生血管形成的影響，從而為視網(wǎng)膜血管增生性疾病的藥物治療提供新的思路。

材料與方法

1.動物及分組選用出生7天的健康昆明小鼠（由青島市藥檢所動物實驗中心提供）28只，雌雄兼用，與哺乳母鼠共同飼養(yǎng)，隨機分為4組，每組7只。正常對照組：在正?？諝猸h(huán)境下飼養(yǎng)10天，不做任何處理；高氧組：在高氧環(huán)境下飼養(yǎng)5天，后在正常環(huán)境飼養(yǎng)5天，不注射藥物；PEDF干預(yù)組：在高氧環(huán)境下飼養(yǎng)5天，行玻璃體腔內(nèi)注射PEDF，后置于正常環(huán)境中飼養(yǎng)5天；生理鹽水組：在高氧環(huán)境下飼養(yǎng)5天，行玻璃體腔內(nèi)注射生理鹽水，后置于正常環(huán)境下飼養(yǎng)5天。

2.高氧誘導(dǎo)建立小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型將鼠齡7天的幼鼠與同籠的1只哺乳母鼠一起置于密閉的氧箱內(nèi)，另1只同籠的母鼠飼養(yǎng)在正常氧環(huán)境中作為替換母鼠。氧箱一端為進氣孔，接入100%濕潤醫(yī)用氧氣，流量控制在0.50~0.85 L/min， 氧箱內(nèi)氧分壓維持在75%±2%；另一端為出氣孔，與水封瓶連接，頂端有測氧孔，用測氧儀監(jiān)測氧箱內(nèi)的氧分壓，確保氧濃度恒定。每日1次打開氧箱加食、換水、替換母鼠。環(huán)境溫度控制在23±2℃。

3.眼球標本的取材和固定氯胺酮(40~50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射，麻醉幼鼠，在手術(shù)顯微鏡下分開幼鼠上下眼瞼，用0.5%的卡因點眼，輕壓眶緣組織，使眼球脫出；用30 G自制針頭于角膜緣稍后進針；PEDF干預(yù)組注射PEDF 1 μl（2.5 μg/ml)，生理鹽水對照組注射生理鹽水1 μl；將眼球復(fù)位，0.25%氯霉素眼水點眼。各組幼鼠均于生后第17天取材，氯胺酮腹腔內(nèi)注射麻醉成功后，暴露心臟，用37℃生理鹽水和4%多聚甲醛灌注；摘除眼球，置于4%多聚甲醛固定；流水沖洗、常規(guī)酒精脫水、二甲苯中透明、60℃石蠟浸蠟然后包埋，備用。

4.視網(wǎng)膜組織切片HE染色將包埋好的眼球標本，做與視神經(jīng)矢狀軸平行的視網(wǎng)膜連續(xù)切片，選取切片時避開視盤周圍，切片厚6 μm，每個標本取20張切片，置于干凈載玻片上，二甲苯脫臘、酒精復(fù)水、蘇木素染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察并照像記錄。

5.SABC免疫組織化學(xué)法檢測血管內(nèi)皮細胞特異性抗體的化學(xué)標志CD31分子的表達從高氧組中選取視網(wǎng)膜組織切片，常規(guī)二甲苯脫臘，梯度酒精復(fù)水；3%H2O2室溫孵育，室溫下胰酶消化，微波修復(fù)，然后滴加1∶25稀釋的兔抗人因子相關(guān)抗原多克隆抗體， PBS沖洗，后滴加稀釋的生物素標記二抗，37℃孵浴，PBS沖洗；滴加稀釋的辣根酶標記鏈酶卵白素，37℃孵浴，PBS沖洗；DAB染色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，光鏡觀察。

6.視網(wǎng)膜組織切片的制作與觀察①HE染色：光鏡下觀察結(jié)果。每只眼球選取20張切片，計數(shù)與視網(wǎng)膜內(nèi)界膜有聯(lián)系的血管內(nèi)皮細胞細胞核。②免疫組織化學(xué)染色：從給氧組中隨機抽取20張未經(jīng)染色的視網(wǎng)膜組織切片，應(yīng)用對血管內(nèi)皮細胞特異性免疫細胞化學(xué)標志的CD31分子行免疫組織化學(xué)檢查。以血管內(nèi)皮細胞細胞質(zhì)中見棕黃色顆粒為陽性。

7.監(jiān)測小鼠體重的方法各組小鼠生后第12天始，每天同一時間用電子天平稱量體重一次，直至第17天，觀察小鼠第12天至第17天每天的體重變化。

8.統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS10.0 for windows軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組間均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.視網(wǎng)膜組織切片HE染色正常組未見明顯的突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞細胞核，見圖1；高氧組和生理鹽水組則顯著增多，有的形成新生血管芽，有的形成新生血管團，見圖2、圖3；PEDF干預(yù)組突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞細胞核明顯減少，見圖4。生后第17天正常組、高氧組、PEDF干預(yù)組及生理鹽水對照組平均每只眼球突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞細胞核數(shù)分別為（0.74±0.21）個、（28.27±3.14）個、（4.25±0.37）個、（26.83±2.80）個，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2238.07， P<0.05），其中高氧組與正常組、PEDF干預(yù)組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q=390.14，P<0.05）；PEDF干預(yù)組與生理鹽水對照組相比，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（q=275.37，P<0.05）；生理鹽水對照組與高氧組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=1.49，P>0.05）。

2.CD31免疫組織化學(xué)染色隨機選取17 d齡給氧組小鼠視網(wǎng)膜組織切片20張，經(jīng)CD31免疫組織化學(xué)染色識別血管內(nèi)皮細胞。實驗結(jié)果顯示給氧組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜玻璃體面細胞胞漿呈棕黃色陽性反應(yīng)，表明這些細胞為內(nèi)皮細胞，證實它們?yōu)檠茉葱?。見圖5。

圖5視網(wǎng)膜組織CD31免疫組織化學(xué)染色（HE×400）

3.體重變化生后第12~17天正常組、高氧組、PEDF干預(yù)組與生理鹽水對照組小鼠平均體重變化各組間比較(F=0.39，P>0.05)，PEDF局部治療對小鼠的生長發(fā)育無明顯影響。見表2。

討論

臨床上，視網(wǎng)膜新生血管常見于糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等缺血性視網(wǎng)膜疾病。由于危害視力嚴重，一直是眼科關(guān)注的熱點。研究表明^[3，4]：缺血缺氧是視網(wǎng)膜新生血管產(chǎn)生的始動因素。抑制新生血管生長才是治療此病的關(guān)鍵，因此新生血管抑制因子的治療已成為較有前景的新生血管治療方法。

1.視網(wǎng)膜新生血管動物模型的制備科學(xué)可行的動物模型是研究視網(wǎng)膜新生血管形成機制及新生血管的治療方法療效評價的前提條件。理想的動物模型應(yīng)當在疾病的發(fā)生發(fā)展以及病理檢查等方面相同或有極大的相似性，且模型有容易制作、便于觀察、可以重復(fù)和能定量分析等特點。目前應(yīng)用最廣的模型是氧致小鼠視網(wǎng)膜新生血管動物模型^[5]，小鼠模型新生血管發(fā)生率為100%，且可重復(fù)性好，而且有可定量的最大優(yōu)點，本實驗中，我們就采用此種動物模型。正常小鼠視網(wǎng)膜血管的發(fā)育在生后2周。生后第7天視網(wǎng)膜血管發(fā)育尚不成熟，此時置于高氧環(huán)境中，在高氧刺激下，視網(wǎng)膜血管發(fā)生收縮甚至閉塞，形成視網(wǎng)膜無灌注區(qū)^[6]。再將幼鼠移回正常空氣環(huán)境中，可以引發(fā)視網(wǎng)膜無灌注區(qū)缺血缺氧，2天后即可產(chǎn)生視網(wǎng)膜新生血管，在生后17~21天尤其是17天達到高峰。本研究中，我們選擇遺傳背景一致的健康昆明小鼠，建立高氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型，使全部實驗動物產(chǎn)生基本一致的血管增生性反應(yīng)，與正常對照組存在明顯差異，證實本次實驗動物模型誘發(fā)成功。評價新生血管的指標：一是通過視網(wǎng)膜鋪片上血管生長的范圍密度、新生血管芽的多少來反映視網(wǎng)膜新生血管的增殖程度。另一種方法即通過組織學(xué)計數(shù)切片上血管內(nèi)皮細胞突破內(nèi)界膜的數(shù)量即可反映新生血管的增殖狀態(tài)。前者是定性的方法，后者是定量的方法，均具有科學(xué)性和可行性。

2.局部注射的方法有資料顯示^[7]，全身使用PEDF如腹腔注射，需要的劑量較大，可能會干擾機體血管再生的整體調(diào)節(jié)，如在創(chuàng)傷和外周循環(huán)閉塞的情況下影響血供的恢復(fù)、傷口的愈合，從而增加全身的不良反應(yīng)。由于眼部位置局限且表淺，局部注射有一定的優(yōu)勢。局部注射包括2種方式：玻璃體內(nèi)注射和視網(wǎng)膜下注射。實驗中，我們采用局部注射即玻璃體腔內(nèi)注射，既避免出現(xiàn)全身并發(fā)癥，又能更好地維持眼內(nèi)的治療濃度。且小鼠眼球容易脫臼，暴露好，角膜緣邊界清楚，易于定位，我們用30 G自制針頭行玻璃體內(nèi)注射，操作方便，并發(fā)癥少。

3.PEDF對小鼠視網(wǎng)膜新生血管的作用PEDF是一種內(nèi)源性細胞因子，主要由RPE產(chǎn)生，具有保護神經(jīng)視網(wǎng)膜，特別是光感受器的重要生理作用，是視網(wǎng)膜正常發(fā)育必需的營養(yǎng)因子。Dawson等^[2]還認為PEDF是一種重要的內(nèi)源性新生血管的抑制因子。有研究報道體內(nèi)體外實驗中PEDF可以通過抑制血管生成從而抑制多種腫瘤的生長，其用于腫瘤治療的潛在可能性已引起人們的注意。但PEDF是否對眼部新生血管有抑制作用？實驗中，我們用自制針頭通過硅膠管連于微量進樣器自角鞏膜緣穿刺，向小鼠玻璃體腔內(nèi)注射PEDF 1 μl (2.5 μg/ml)，觀察其對視網(wǎng)膜新生血管形成的影響。結(jié)果表明，一定劑量的PEDF對視網(wǎng)膜新生血管形成具有抑制作用，PEDF干預(yù)組與高氧組和生理鹽水對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但PEDF尚不能完全抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成。PEDF干預(yù)組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明PEDF僅能部分抑制視網(wǎng)膜新生血管形成。分析原因可能有：首先視網(wǎng)膜新生血管的生長是一個復(fù)雜的過程，需要多種因子參與，單一因素并不能阻止新生血管的生長；另外，PEDF的作用效果呈量效關(guān)系^[8]，若劑量不足夠大，也不能完全抑制新生血管形成。 PEDF抑制視網(wǎng)膜新生血管形成的具體機制目前尚不明確，推測有以下可能：一是可能通過促進活化的血管內(nèi)皮細胞凋亡，使血管內(nèi)皮細胞對缺氧誘發(fā)的新生血管的信號不起反應(yīng)^[7]。二是可能通過作用于細胞黏附分子來調(diào)節(jié)其抑制新生血管的活性，即通過細胞外基質(zhì)來調(diào)節(jié)其抑制血管內(nèi)皮細胞增生的活性^[9]。三是PEDF還可以通過其抗氧化特性減輕糖基化終產(chǎn)物對血管周細胞的損害^[10]，起到保護作用，從而發(fā)揮治療作用。本研究中，我們向玻璃體內(nèi)注射一定劑量的PEDF，觀察視網(wǎng)膜組織切片，未見到明顯異常。監(jiān)測各組小鼠體重，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明局部注射PEDF并不干擾小鼠的正常生長發(fā)育，預(yù)示了PEDF治療眼內(nèi)新生血管的安全性和可行性。

由于視網(wǎng)膜本身主要由神經(jīng)組織構(gòu)成，且發(fā)生缺血缺氧損害時易產(chǎn)生視網(wǎng)膜新生血管，PEDF作為一種內(nèi)源性因子，不僅具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，可以保護神經(jīng)組織免遭毒性損害 ，而且還可以抑制新生血管的形成，這預(yù)示了PEDF預(yù)防和治療血管增生性眼病的可行性和廣闊前景，PEDF有望成為防治血管增生性視網(wǎng)膜病變的一種有效藥物。

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(收稿日期：2006-03-27修回日期：2006-05-28)

(編輯：潘明志英文審校：鐘京梓)

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文