【摘要】目的研究凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，了解該基因突變?cè)谥袊鴿h族人群中的分布頻率。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)結(jié)合Hin6I酶切分析、瓊脂糖凝膠電泳確定基因型，對(duì)106例漢族腦梗死患者及120例正常人進(jìn)行檢測(cè)，分析凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因多態(tài)性特點(diǎn)。結(jié)果腦梗死組Val34Leu雜合突變頻率為3.8%，正常對(duì)照組為1.7%，兩組間基因型頻率分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。結(jié)論腦梗死患者凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因突變頻率與正常人群無顯著性差異，建立的PCRRFLP方法適用于凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因突變的檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】聚合酶鏈反應(yīng)；凝血因子ⅩⅢ；基因突變

文章編號(hào)：1003-1383(2006)03-0237-03

中圖分類號(hào)：R 446.62文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Analysis of coagulation factor ⅩⅢ Val34leu gene polymorphism in patients with cerebral infarction by PCRRFLP method

XIE Chunying， PAN Chunyan， TU Chunqing， WU Jianzeng， YE Guoqiang， DENG Chunyan.

(Department of laboratory science， Bao'an People's Hospital， Shenzhen， 518101， China)

【Abstract】ObjectiveTo establish a method for coagulation factor ⅩⅢ (FⅩⅢ) Val34leu gene polymorphism and study the frequency of genetic mutation in the Chinese Han population.

MethodsThe Val34leu genewas detected by combining the polymerase chain reaction (PCR) with Hin6I enzyme analysis and agarose gel electrophoresis in 106 patients with cerebral infarction and 120 normal controls. The characteristic of FⅩⅢ Val34Leu polymorphism was studied.ResultsThe Val34Leu heterozygote frequency in cerebral in fraction group and normal group was 3.8% and 1.7% respectively. The genetype frequency between the two groups had no difference. The gene frequency of Leu34 allele was 0.8%， which was lower than that of white people (27%).Con

clusionGene mutation of Val34Leu polymorphism has some differences in races or region. The polymerase chain reactionrestriction of fragment length polymorphism (PCRRFLP) methods is suitable for detection of FⅩⅢ Val34Leu gene mutation.

【Key words】polymerase chain reactionrestriction; coagulation factorⅩⅢ; gene polymorphism

凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)又稱纖維蛋白穩(wěn)定因子，是一種轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原，在正常止血和傷口愈合過程中起重要作用，激活后的血漿FⅩⅢ是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其活性范圍大，可能與FⅩⅢ基因多態(tài)性有關(guān)，而FⅩⅢ基因多態(tài)性可能是動(dòng)、靜脈血栓形成的一個(gè)保護(hù)性遺傳因素^[1，2]，近年來引起了國內(nèi)外科學(xué)家們的密切關(guān)注，國內(nèi)學(xué)者鮮有報(bào)道。為了解我國漢族人群FⅩⅢVal34Leu基因變異頻度，我們建立了PCRRFLP檢測(cè)方法，對(duì)106例腦梗死患者和120例正常漢族人群血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

1.材料

(1)標(biāo)本來源106例漢族腦梗死患者為深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院患者，男性58例，女性48例，年齡35~87歲，符合1996年全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)CT或MRI證實(shí)。正常對(duì)照120例來自本院漢族健康體檢者，無缺血性心、腦血管病史及靜脈血栓史。于清晨空腹抽取病例及對(duì)照組外周血2 ml，EDTA抗凝，凍存于-20℃待測(cè)。

(2)試劑分離純化試劑盒(Puregene DNA isolarion Kits)為Gentra公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶、dNTPmix、Hin6I限制性內(nèi)切酶及分子量標(biāo)準(zhǔn)PUC19DNA/MspI為MBI公司產(chǎn)品；EZ Spin column PCR Product Purification Kit為Sangon公司產(chǎn)品。

(3)引物設(shè)計(jì)和合成根據(jù)Balogh等^[3]設(shè)計(jì)的引物，上游序列5’ACT TCC AGG ACC GCC TTT GGA GGC3’，下游序列5’GT TGA CGC CCC GGG GCA CCG-3’，下游序列3’端下劃線的G為一錯(cuò)配堿基(原為A)，可以在正常序列(GCGC)中引入一個(gè)Hin6I酶切位點(diǎn)，而在變異序列(GCTC)中無Hin6I酶切位點(diǎn)。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

(4)儀器PE9600型擴(kuò)增儀系美國PE公司產(chǎn)品；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)為美國Sigma產(chǎn)品，KODAK1D型凝膠成像系統(tǒng)購自美國IEC公司。

2.方法

(1)基因組DNA抽提取300 μl全血加入900 μl紅細(xì)胞裂解液，充分混合，室溫下孵育1分鐘，在相對(duì)離心力(RCF)13000~16000 g下離心20秒鐘，留下可見的白細(xì)胞層，再加入300 μl細(xì)胞裂解液混勻，然后經(jīng)蛋白質(zhì)沉淀、DNA沉淀、溶解，快速分離DNA。

(2)聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)體系及條件參照文獻(xiàn)^[3]并略加改進(jìn)?？傮w積為25 μl，含200 μmol/l dNTP，上、下游引物各10 pmol， 2.0 mmol/L MgCl2， 0.4 UTaq酶和0.5 μgDNA模板。反應(yīng)條件為95℃3 min；循環(huán)：94℃1 mim，55℃1 min，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)；延伸72℃10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為114 bpDNA片段。

(3)限制性內(nèi)切酶分析產(chǎn)物經(jīng)EZ Spin column PCR Product Purification Kit純化，取純化的產(chǎn)物10 μl，用限制性內(nèi)切酶Hin 6 I10U，37℃消化過夜，反應(yīng)體積20 μl，取5 μl消化后產(chǎn)物在30 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，溴乙錠染色，紫外燈下觀察結(jié)果。

(4)基因型鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物114 bp片段中存在一個(gè)Hin6酶切位點(diǎn)，可將片段切成94 bp、20 bp兩個(gè)片段，當(dāng)FⅩⅢa亞單位2號(hào)外顯子上的34號(hào)密碼子發(fā)生GT突變，導(dǎo)致其編碼的纈氨酸被亮氨酸替代時(shí)，則消除了Hin6酶切點(diǎn)，因此，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳所見區(qū)帶的位置，以PUC19DNA/MspI/Maker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量，從而鑒定基因型為突變純合子或Val34Leu雜合子或Val34野生型。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)組間基因型頻率的差異進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

結(jié)果

1.基因型電泳圖譜PCR產(chǎn)物經(jīng)Hin6I酶切后瓊脂糖凝膠電泳只可見94 bp一條區(qū)帶，則受檢個(gè)體為Val34野生型(20 bp片段分子量較小而難以顯示)，如可見114 bp和94 bp兩條區(qū)帶者為Val34Leu雜合子，只可見114 bp條帶者為Leu34突變純合子，見圖1。

1，2，3，5，6，7：Val/Val；8：Val/Leu雜合子；

4：酶切前PCR產(chǎn)物；M: PUC19DNA/MspI/Maker圖1FⅩⅢVal34Leu基因型電泳圖

2.兩組FⅩⅢVal34Leu基因型分布頻率比較對(duì)照組FⅩⅢVal34Leu雜合突變頻率為1.7%，Leu34等位基因頻率為0.8%，腦梗死組的Val/Leu雜合突變率為3.8%，對(duì)照組為1.7%，兩組均未見純合突變型。兩組基因型及等位基因分布頻率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

討論

FⅩⅢ是由2 a亞單位和2 b亞單位組成的四聚體，分子量為320 kb，活性部位在a亞單位，對(duì)FⅩⅢ亞單位缺失者的基因研究中發(fā)現(xiàn)了四種突變，其中編碼FⅩⅢa亞單位基因的第2外顯子163位有GT點(diǎn)突變，使a亞單位34位的纈氨酸變成亮氨酸(FⅩⅢVal34Leu)，故人群中出現(xiàn)三種基因型(多態(tài)性)：野生型Val/Val，雜合突變型Val/Leu，純合突變型Leu/Leu。多數(shù)研究認(rèn)為，Val/Leu突變可能會(huì)防止病人的血栓形成，但可能是原發(fā)性腦出血的一種危險(xiǎn)因素^{[1，2，4]}。也有報(bào)道認(rèn)為Val34Leu突變與血栓形成沒有明顯關(guān)系，而同源Leu34等位基因才具有保護(hù)性作用，其原因在于這種等位基因可以增加血液中FⅩⅢ的濃度，從而加強(qiáng)了纖維蛋白交聯(lián)的形成。

不同種族、不同國家FⅩⅢVal34Leu多態(tài)性基因頻率的差異性很大，這可能是造成血栓性疾病在不同地區(qū)發(fā)生率不同的原因之一。據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)道^[5]，澳洲人基因頻率Val34為73%，Leu34為27%，德國人Val34為89%，Leu34為11%，日本人Val34與Leu34的頻率分別為99%和1%。我們研究106例腦梗死患者和120例正常人的FⅩⅢVal34Leu基因頻率，結(jié)果顯示，正常漢族人群中Leu34等位基因頻率為0.8%，明顯低于白種人，與日本人群相似^[6]，與國內(nèi)謝汝萍等^[4]的研究結(jié)果(0.7%)基本一致，表明了黃種人(漢族)基因頻率比白種人低，F(xiàn)ⅩⅢVal34Leu突變頻率在腦梗死與正常人組之間的差異無顯著性，提示FⅩⅢVal34Leu可能并非漢族人群血栓性疾病的保護(hù)性遺傳因素^[7，8]，采用PCRRFLP法檢測(cè)凝血因子ⅩⅢVal34Leu突變，對(duì)研究FⅩⅢ多態(tài)性與心腦血管性疾病的關(guān)系有一定意義。

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［8］涂傳清，吳建增，謝春英，等.漢族人群凝血因子ⅩⅢVal34Leu多態(tài)性與動(dòng)靜脈血栓性疾病的關(guān)系［J］.中國臨床康復(fù)，2005，9(1)：70-71. 

(收稿日期：2006-04-10修回日期：2006-06-05)

(編輯：梁明佩英文審校：鐘京梓)

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文