doi：10.3969/j. issn.0517-6611.2025.15. 015

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Studyonthe ImmuneResponseofMicetolactococus lactis VectorVaccine Expressing Pseudomonasaeruginosa OuterMembrane ProteinI CHENQng-yan，QUXiao-jun（InovationResearch CenterforMicrobialPhrmacolog/IstituteofMicrobiology，HeilongjiangAcademy of Sciences，Harbin，Heilongjiang 150010）

AbstractObective]ToevaluatetheimmuneresposeofcleanmicetorecombinantLactococcus lactisvectorvacinsexpresingPsedo monaseruginosaoutermembraneproteinI，andlaythefoundationforthedevelopmentofvacines thatcanpreventandtreatPseudomonas aeruginosaifection.MethodTevectoacceandLctococuslctissuspensioneredmiisteredoallytimmuedmcdth 35thdayaftertistimuzatioteiceerecalengdwitseudomonsrugosndandyicaldsloatioeng andsplens weildwegdddlutetecesasaigatiosoutiondngisseomogatendotticlue mediumtocalculatetheumbeofviablebacteriaTeungsofthemcewerefedwithitubatioandtainedwithematoxylinosiingand thecllsweresevdtroughiagingsstem.Miceardiacpunctureereefoedtospaatebodandafullutomatedilood analyzerwsudtantiftaiteoodclstroils，podoosldaatengsegte red blood cells，incubate with fluorescently labeled antibody mixture at 4°C ，and analyze by flow cytometry;filtrationof splenic cell homogenatesurfacesgditracellagalysisfetupeatatofng semogeatesudt γ ， IL- 1β ，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，KC-GRO，IL-10，IL-17，and TNF- α using a detection kit;ELISA method was used to detect the level of pathogen specficntibodiesiniceserum.ResultomparedwithtegoupimuniedwithLactocouslctisMG36trn，thevectorvacine munizationgroupshowedasignifcantreductioninthladofPseudomonaseruginosainthenasalcavityandlungscausedbyhalgeand thecaievcineouldduceteespatorctdofedomoaserugios;vectorvainouldeetiveldueeieasein lungweightinicecausedbyviralatackssedomoasrugnoifectionladedtoruimentofutrophilsinthelungsoficeile vectorvaccinsoulddueintofplooclearlukocsinlngtisueadiceaseteproportioofiulatigoils; the post viral vectorvaccineimmunizedmice inducedaTh1typeimmuneresponse，increasedthe proportionofTh17cels toCD ⁴⁺ cells in the spleen，andeectielyducdicetroducesigicantIgGdIgatibdies.onlusionisexprintivestigatedte sponseofmicetotepreviouslyonstructedvectorvaccineonfiingthatthevectorvaccecanfectivelypreventandtreatPsedmonas aeruginosa infection，thus providing certain technical support forthe development of Pseudomonas aeruginosa vaccines.

KeyWordsVector vaccine;Immunity;Histology;Hematology;Flow cytometry;Cellfactor

銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa，Pa）是臨床常見多重耐藥超級(jí)細(xì)菌之一，可引起人體燒創(chuàng)傷部位感染、角膜炎、肺炎、敗血癥等；養(yǎng)殖業(yè)可引起奶?；蚰萄蛉榉垦祝醭鲅苑窝?，仔豬腹瀉，雛雞各類感染，包括肺炎、肝周炎、心肌炎、敗血癥等，對(duì)人體健康和畜牧業(yè)造成了極大的危害和經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。疫苗免疫可以有效預(yù)防和治療銅綠假單胞菌的感染，解決抗生素耐藥導(dǎo)致療效不佳這一難題[4-6]。以乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）為載體的基因工程活載體疫苗安全性高，毒副作用低，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫等各類型的免疫反應(yīng)，具有極大的發(fā)展?jié)摿7-8]。Pa 外膜蛋白I（Outer membrane protein I，oprI? 可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生多種免疫應(yīng)答，且在不同血清型 Pa 之間可以提供交叉保護(hù)，是一種優(yōu)秀的疫苗研制靶蛋白[9-11]筆者旨在解析小鼠對(duì)前期構(gòu)建的表達(dá) Pa 外膜蛋白I重組 L. lactis載體疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)，以期為研發(fā)可防治 Pa 感染的重組載體疫苗提供技術(shù)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試劑、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株表達(dá)Pa外膜蛋白I的重組 L. lactis載體疫苗（OprI-pMG36c-MG1363），中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；紅細(xì)胞裂解液、熒光標(biāo)記抗體混合物、特異性細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)記物、BD PharmingenTM 轉(zhuǎn)錄因子緩沖液、Fix/Perm緩沖液 ?.Perm/Wash 緩沖液，美國(guó)BD公司生產(chǎn);V-PlexPlusProInflammatoryPanel1小鼠多重檢測(cè)試劑盒、小鼠IL-17超敏試劑盒，美國(guó)Meso ScaleDiscovery公司生產(chǎn)； 1% 胎牛血清（FBS），美國(guó)ThermoFisherScientific公司生產(chǎn)；多聚甲醛組織固定液、蘇木精和伊紅染液，德國(guó)MERCK公司生產(chǎn)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、假單胞分離瓊脂（PIA）培養(yǎng)基，青島海博生物有限公司生產(chǎn)；其他試劑市售所得，均為AR級(jí)。ICR品系清潔級(jí)小白鼠，雌性，中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室自繁自養(yǎng)。銅綠假單胞菌PaO1菌株，為中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室保存。乳酸乳球菌MG1363菌株，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。試驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，于2023年4月至2024年5月進(jìn)行。

1.2主要儀器EVOSXL細(xì)胞成像系統(tǒng)，美國(guó)ThermoFisherScientific公司生產(chǎn)；HEMAVET950FS全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀，美國(guó)DREW公司生產(chǎn)；BDLSRFortessa流式細(xì)胞分析儀、Micro-tainer采血管（含EDTA- ?K₂ ），美國(guó)BD公司生產(chǎn)；TGL-16GB型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；357538型Dounce玻璃勻漿器，桂寧（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司生產(chǎn)。

1.3疫苗制備 OprI-pMG36c-MG1363重組菌株按 1%V/V 比例接種含氯霉素（ 6μg/mL ）的GM17液體培養(yǎng)基， 30% 培養(yǎng) 0D₆₀₀ 至1.0，離心收集菌體，PBS溶液洗滌2次，制成濃度5.0×10⁹ CFU/mL菌懸液， 4^°C 保存。

1.4小鼠免疫ICR品系清潔級(jí)雌性小白鼠63只，體重 18～ 22g ，平均分成3組：乳酸乳球菌免疫未攻毒組，乳酸乳球菌免疫攻毒組，載體疫苗免疫攻毒組。免疫用的乳酸乳球菌MG1363菌懸液和載體疫苗濃度均為 5.0×10⁹CFU/mL ，免疫方式為灌胃免疫，每7d免疫3次，每次 0.2mL ，共免疫 21d 1.5細(xì)菌攻毒銅綠假單胞菌PAO1菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上 37^°C 培養(yǎng) 24h ，將菌體從培養(yǎng)基上拭下，懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中， 2 000×g 離心 15min ，收集沉淀，用新鮮PBS稀釋至 1.0×10⁹CFU/mL，4^°C 保存。首次免疫后第35天，用上述濃度 PaO1 菌株新鮮菌懸液鼻腔黏膜噴霧攻毒，劑量為20μL 分別在攻毒后 ^18h 和7d后，采用頸椎脫白處死法對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，無(wú)菌取出每只小鼠的肺和脾臟并稱重。

1.6小鼠呼吸道細(xì)菌載量檢測(cè)用 1mL 無(wú)菌PBS沖洗鼻腔，收集洗鼻液;肺樣本加入 1mL 無(wú)菌PBS，勻漿器均質(zhì)。將每只小鼠的鼻腔沖洗液和肺組織勻漿物連續(xù)稀釋并涂布在PIA培養(yǎng)基平板上， 37°C 培養(yǎng) 24～48h ，計(jì)算活菌數(shù)量。

1.7組織學(xué)檢查將攻毒后 ^18h 的小鼠肺部插管，注射1 mL 4%（W/V） 多聚甲醛組織固定液。將樣品在10倍體積的固定液中固定 48h ，蘇木精-伊紅（HE）染色。載玻片在細(xì)胞成像系統(tǒng)上放大100倍成像。

1.8血液學(xué)分析攻毒后 ^18h ，心臟穿刺分離血液，置于Microtainer采血管（含EDTA- ?K₂ ）中，振蕩。采用全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀對(duì)總白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)行定量。

1.9流式細(xì)胞術(shù)分析用 100μm 細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾分離肺組織勻漿物， 1200×_g 離心 8min 。沉淀懸浮于 1mL 紅細(xì)胞裂解液中， 37^°C 下孵育 3min 。離心，懸浮在含 1% 胎牛血清PBS中，冰上孵育 15min 。細(xì)胞與熒光標(biāo)記抗體混合物在4^°C 暗室中孵育1h，沉淀樣品，懸浮于 500μL PBS中，流式細(xì)胞分析儀分析。

攻毒后7d處死的小鼠脾細(xì)胞勻漿器均質(zhì)，細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾。用特異性細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)記物對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行染色。表面染色細(xì)胞 1 200×g ，離心 8min ，懸浮于PBS中。使用轉(zhuǎn)錄因子緩沖液進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，細(xì)胞 4°C，1mL 1× Fix/Perm緩沖液固定和滲透 50min ，用 1mL 1×Perm/Wash 緩沖液洗滌細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)染色 50min 。然后將脾細(xì)胞沉淀、洗滌并懸浮于 500μL PBS中，流式細(xì)胞分析儀分析。

1.10細(xì)胞因子分析肺組織勻漿物 15000×g ，離心 5min ，收集上清液，使用小鼠多重檢測(cè)試劑盒檢測(cè)干擾素 γ（IFN- γ ）、白細(xì)胞介素 -1β.IL-2.IL-4.IL-5.IL-6.KC-GRO.IL-10 和 TNF-α 。使用小鼠IL-17超敏試劑盒測(cè)量IL-17水平。試驗(yàn)方法及結(jié)果分析按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.11血清學(xué)檢測(cè)小鼠攻毒后 ^18h ，采用心臟穿刺分離血液， 15000×g 離心 5min ，收集上清液。小鼠血清中病原特異性抗體采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)。血清樣本1：50 稀釋，加人封閉緩沖液中，然后連續(xù)稀釋。ELISA檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)12-13]。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件為SPSS20.0軟件， Plt;0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1載體疫苗可減少銅綠假單胞菌在呼吸道定殖載體疫苗和乳酸乳球菌菌懸液分別灌胃免疫小鼠后，用PAO1菌株鼻腔攻毒， 18h 后檢測(cè)鼻腔和肺部PAO1菌株的定殖情況，結(jié)果顯示：與乳酸乳球菌免疫組相比，載體疫苗免疫組小鼠鼻腔和肺部的銅綠假單胞菌載量顯著減少（ Plt;0.01? （圖1）。

2.2載體疫苗可有效減少攻毒后小鼠肺部重量增加機(jī)體呼吸道感染銅綠假單胞菌，會(huì)引起免疫細(xì)胞和體液流入肺部，從而導(dǎo)致肺部重量增加[14]。試驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸乳球菌免疫組小鼠攻毒后，與未攻毒小鼠相比，肺部重量增加顯著，這也證實(shí)了Kipnis等[4的研究結(jié)果；載體疫苗免疫組小鼠在攻毒后肺重量較乳酸球菌免疫組增加明顯減少（圖2）。

2.3載體疫苗可減少肺組織多形核白細(xì)胞招募PAO1菌株攻毒后，采集小鼠肺組織，固定，HE染色，切片，組織學(xué)分析。乳酸乳球菌免疫組小鼠被攻毒后，可觀察到大量多形核白細(xì)胞，而載體疫苗免疫組小鼠肺泡中多形核白細(xì)胞相對(duì)較少（圖3）。

2.4PAO1菌株攻毒導(dǎo)致小鼠肺部中性粒細(xì)胞招募肺組織流式細(xì)胞術(shù)顯示，小鼠被攻毒后，肺部可觀察到髓系細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞顯著增加，這表明銅綠假單胞菌感染導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在感染的急性期被招募到肺部，這種細(xì)胞流入也導(dǎo)致肺重量增加。雖然載體疫苗免疫能夠降低肺重量和肺細(xì)胞的招募，但其不會(huì)改變招募到肺的先天免疫細(xì)胞的整體組成（圖4）。

圖1載體疫苗免疫組和乳酸乳球菌免疫組小鼠鼻腔（A）和肺部（B）細(xì)菌載量

圖2PAO1菌株攻毒和未攻毒免疫組小鼠肺部重量增加情況 Fig.2The increase in lung weight in mice of PAO1 stain challenged and control immunized groups

2.5載體疫苗能增加循環(huán)中性粒細(xì)胞比例攻毒后，小鼠骨髓中會(huì)釋放免疫細(xì)胞，在血液中循環(huán)到達(dá)感染部位對(duì)抗感染[15]。攻毒后 ^18h 血液學(xué)分析表明，乳酸乳球菌免疫組小鼠和載體疫苗免疫組小鼠白細(xì)胞總數(shù)變化差異不顯著，但是與未攻毒小鼠相比，均差異顯著（ Plt;0.01 （圖5A）。白細(xì)胞類型發(fā)生了變化，與未攻毒小鼠相比，乳酸乳球菌免疫組攻毒小鼠循環(huán)中性粒細(xì)胞比例更高，而載體疫苗免疫組攻毒小鼠中更為明顯（ Plt;0.01 （圖5B）。

2.6攻毒可誘導(dǎo)載體疫苗免疫組Th1型免疫反應(yīng)小鼠感染后，細(xì)胞因子能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞在血液中循環(huán)和感染部位招募[15]。PAO1菌株攻毒 ^18h 后，小鼠肺上清液細(xì)胞因子分析表明，與未攻毒小鼠相比，免疫組小鼠攻毒后均會(huì)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子 IL-1β，IL-6，GRO/KC，TNF-α 和 IL-10顯著增加；與未攻毒小鼠相比，載體疫苗免疫組小鼠攻毒后 IFN-γ ig.3Imaging of PAO1 strain challenged mice lung slices at 100× magnification增加明顯，這表明載體疫苗免疫后，針對(duì)銅綠假單胞菌感染可誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)（圖6）。

圖3PAO1菌株攻毒后小鼠肺切片100倍放大倍數(shù)下成像

圖4肺勻漿物單細(xì)胞中髓系細(xì)胞和中性粒細(xì)胞群比例 （n=7） ）Fig.4The ratio of myeloid cells and neutrophilspopulations inunicell of lung homogenate（ n=7 ）

注： *****.Plt;0.001，*****.Plt;0.0001，

2.7載體疫苗免疫可增加脾臟中Th17細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比

例攻毒后7d，小鼠脾細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析表明，未攻毒組、乳酸乳球菌免疫組和載體疫苗免疫組小鼠的T細(xì)胞總數(shù)、 CD4⁺ 或 CD8⁺T 細(xì)胞亞群變化不明顯（圖7A）；與未攻毒組相比，載體疫苗免疫組的Th17細(xì)胞占 CD4⁺ 細(xì)胞比例增加顯著（ （Plt;0.05） （圖7B）。這也證實(shí)了上述免疫組小鼠攻毒后 ^18h 檢測(cè)到的IL-17增加這一結(jié)果，說(shuō)明載體疫苗免疫在小鼠受到銅綠假單胞菌攻擊時(shí)誘導(dǎo)了Th17型免疫載體反應(yīng)。

2.8載體疫苗可有效誘導(dǎo)小鼠免疫反應(yīng) 載體免疫組小鼠用

PA01菌株攻毒 18h 后，ELISA法檢測(cè)小鼠血清中針對(duì)銅綠假單胞菌特異性抗體，結(jié)果表明，載體疫苗免疫組IgG和IgA產(chǎn)生明顯，證實(shí)了載體疫苗可有效誘導(dǎo)小鼠的免疫反應(yīng)（圖8）。

Fig.5Proportion of blood cell populations in mice of challenged and control groups（ n=7 ）

圖6免疫后小鼠肺上清液細(xì)胞因子水平變化

Fig. 6Changes of cytokine levels in lung supernatant of immunized mice

圖7載體疫苗免疫增加脾臟中Th17細(xì)胞占 CD4⁺ 細(xì)胞比例

注： ?.Plt;0.05. 0

Fig.7 Vector vaccine immunization increases the proportion of Th17 cells to CD4⁺ cells in thespleen

圖8載體疫苗誘導(dǎo)銅綠假單胞菌特異性抗體產(chǎn)生情況 Fig.8The situation ofspecificantibodiesagainst Pseudomonas aeruginosainducedbyvectorvaccines

注： **.Plt;0.01，***.Plt;0.001

3討論

預(yù)防和治療多重耐藥銅綠假單胞菌感染的最好方法就是接種疫苗，但目前尚缺乏免疫效果良好的銅綠假單胞菌疫苗上市。該研究前期構(gòu)建了表達(dá)銅綠假單胞菌外膜蛋白I的乳酸乳球菌活載體疫苗（OprI-pMG36c-MG1363），為了探究小鼠對(duì)載體疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在首次免疫后第35天，用銅綠假單胞菌對(duì)小鼠進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)，小鼠呼吸道細(xì)菌載量檢測(cè)、組織學(xué)檢查、血液學(xué)分析、流式細(xì)胞術(shù)分析和細(xì)胞因子分析結(jié)果表明：與乳酸乳球菌MG1363菌株免疫組相比，載體疫苗免疫組小鼠鼻腔和肺部因攻毒引起的銅綠假單胞菌載量明顯減少，載體疫苗可減少銅綠假單胞菌在呼吸道定殖;載體疫苗可有效減少因攻毒引發(fā)的小鼠肺部重量增加;銅綠假單胞菌攻毒導(dǎo)致小鼠肺部中性粒細(xì)胞招募反應(yīng)，載體疫苗可減少肺組織多形核白細(xì)胞招募，增加循環(huán)中性粒細(xì)胞比例；攻毒后載體疫苗免疫組小鼠誘導(dǎo)了Th1型免疫反應(yīng)，增加了脾臟中Th17細(xì)胞占 CD4⁺ 細(xì)胞的比例，并可有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的IgG和IgA抗體。該研究證實(shí)了前期構(gòu)建的表達(dá)銅綠假單胞菌外膜蛋白I的乳酸乳球菌活載體疫苗制備成功，可為研發(fā)可防治銅綠假單胞菌感染的疫苗提供技術(shù)支持。

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