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Effect of Multi-walled Carbon Nanotube Rooting Medium on the Growth of Strawberry Virus-free Seedlings

CAO Fan，JINYu-qing，GU Qing-qing et al（Jiangsu Yanjiang Institute of Agricultural Sciences，Nantong，Jiangsu

AbstractObjective]Toestablishastrawberytisueculturesystembasedoncarbonnanotubemediu.[MethodThistudyusedHongyan’strawberseexpietalmaterialtoexploetheifueneofulti-alldarbnoubeoigddifntota tions （25，50 and 100mg/L ）onthe growth of strawbery tisue culture seedlings，and observed the growth of adventitious roots.[Result]The results showedtataddingulti-walledcarbonnanotubes tothestrawberryotingculturemedmsignificantlyimprovedtecalduction rate. Compared with the control group， 50mg/L multi-walled carbon nanotube rooting medium had the best efct， increasing the height of virus-free seedlings by 27.1% ，the total root length by 83.4% ，the total root volume by 163.8% ，and the number of root tips by 70.1% .Microstructuralobservatiosevaledthattheuli-walldarbnnaotubseeabsobdotesufceofthdventitiousosnddidotg glomerate inside them.The survival rate of transplanting after acclimatization was above 95% ，and the young seedlings grew well. [Conclusion] In this study，a multi-walled carbon nanotube rooting medium （ 50mg/L ）suitable for strawberry tissue culture was selected to provide technical support for the application of carbon nanomaterials in strawberry propagation.

Key Words‘ Hongyan’strawberry;Carbon nanotube;Tissue culture;Microstructure;Adventitious root

碳納米管（carbonnanotubes，CNTs）是一種長寬比例大于1000的一維納米級碳結構，具有獨特的機械性、導熱性和電學性能，可改變化學反應或生物結構[1-2]。碳納米管根據(jù)結構類型，分為單壁碳納米管（single-walledcarbonnanotube，SWCNT）和多壁碳納米管（multi-walledcarbonnanotube，MWCNT）。盡管不是植物自身所需的物質(zhì)，多壁碳納米管已經(jīng)逐漸應用于植物學和生態(tài)學研究[3]。關于多壁碳納米管對植物的促生效果，研究發(fā)現(xiàn)外徑 50～630nm 的多壁碳納米管處理可促進小麥幼苗根系細胞的生長，提高根系相關脫氫酶活性，繼而提高幼苗生物量的積累[4]。然而，外徑 13nm 的多壁碳納米管處理會顯著抑制紅菠菜、生菜、黃瓜的生長，使植株根和冠變短，電解質(zhì)泄漏等導致植物細胞死亡[5]。因此，多壁碳納米管對植物生長發(fā)育的影響不同，主要取決于多壁碳納米管的類型、粒徑、濃度、溶解度以及植物種類等[6-8]。此外，多壁碳納米管制備簡單，價格相對低廉，是一種在植物種苗繁育應用中存在巨大潛力的試驗材料。

草莓（FragariaL.）為薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragar-ia）多年生草本植物，是世界上重要的漿果果樹，果實風味獨特，形態(tài)顏色誘人，營養(yǎng)價值豐富，素有“水果皇后”的美稱，在全球經(jīng)濟作物中占有非常重要的地位[9]。目前，草莓種苗問題是制約我國草莓產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要因素之一。草莓種苗繁育主要采用匍匐莖繁育的傳統(tǒng)方式，但隨著繁殖代數(shù)的增加，容易導致病蟲害積累加重，而運用植物組織培養(yǎng)培育的草莓脫毒苗能夠克服長期無性繁殖帶來的品種退化、質(zhì)量和產(chǎn)量低下等問題，從而保持品種優(yōu)良性狀，促進草莓產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展。因此，深人開展草莓組織培養(yǎng)新材料新技術研究，有效提高草莓種苗繁育質(zhì)量是當前草莓產(chǎn)業(yè)急需解決的課題[10] C

筆者以“紅顏”草莓脫毒組培苗為研究材料，探究不同濃度多壁碳納米管的生根培養(yǎng)基對草莓組培苗生長的影響，并觀測不定根根系生長情況，以期篩選出適合草莓組培擴繁的多壁碳納米管生根培養(yǎng)基，旨在為碳納米材料在植物種苗繁育應用方面提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料“紅顏\"草莓外植體材料來源于南通市海門區(qū)春華家庭農(nóng)場，于2023年3—4月在科創(chuàng)中心組培實驗室完成莖尖剝離、消毒和初代培養(yǎng)[1]。初代培養(yǎng)基配方為WPM培養(yǎng)基 +0.5mg/L6- 芐氨基嘌呤 （6-BA）+0.05mg/L 萘乙酸（NAA）。培養(yǎng)室條件為溫度 25～30°C ，光照 1500lx ，光照周期 16h/8h 。 28d 后，選取不定芽良好、增殖效果相近的草莓組培植株備用。

1.2 試驗方法

1.2.1生根培養(yǎng)基制備。生根培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基 + 0.1mg/L 萘乙酸 （NAA）+0.1mg/L 吲哚丁酸（IBA）。設置3個處理組，處理組 T_Ω1 中添加 25mg/L 多壁碳納米管，處理組 T₂ 中添加 50mg/L 多壁碳納米管，處理組 T₃ 中添加100mg/L 多壁碳納米管，且設置1個對照組。每個處理組和對照組設置3個重復，每個重復24瓶。多壁碳納米管（ Σ（? 95% ，外徑 8～15nm ，長度 30～50μm） 來源于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。配制好的生根培養(yǎng)基在高溫高壓滅菌后，搖床晃動至冷卻，使各瓶內(nèi)多壁碳納米管均勻分布在生根培養(yǎng)基中。

1.2.2植株生根培養(yǎng)。2023年4月中旬，待增殖培養(yǎng)基上的不定芽高度約 2cm 時，進行生根培養(yǎng)基接種，每個處理接種72瓶，每瓶接種1株。接種完成后，置于溫度 25～30^°C ！光照 1500lx 光照周期 16h/8h 的條件下進行培養(yǎng)。每隔5d 統(tǒng)計一次愈傷組織形成和每隔 10d 統(tǒng)計不定根誘導率，褐化、污染及死亡發(fā)生情況。培養(yǎng)50d后，統(tǒng)計每瓶植株的高度、總重量、葉片重量和根部重量。每個處理選取10棵用于形態(tài)觀測，其余轉(zhuǎn)移到室溫環(huán)境下放置2d，打開瓶蓋后放置1d，自來水清洗根部后，移栽至草炭土：珍珠巖 =5：1 基質(zhì)、規(guī)格 9cm×9cm 容器內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3形態(tài)觀測。植株生根培養(yǎng)50d后，采用植物圖像分析儀（型號： Si800plus ，上海中晶科技有限公司），對各個處理選取的樣品根系進行掃描，記錄根系總長度、體積、平均直徑和根尖數(shù)等形態(tài)發(fā)育指標。同時，對每個處理不定根樣品進行石蠟切片制作，采用電子顯微鏡（型號：OlympusCX33生物顯微鏡，Evident）對不定根及其橫截面進行微觀結構觀察，判斷多壁碳納米管吸附效果及是否存在于不定根內(nèi)部。

1.3數(shù)據(jù)處理 使用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用DPS和SPSS26.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1愈傷組織和不定根誘導不同多壁碳納米管培養(yǎng)基對草莓植株愈傷組織誘導率見圖1。培養(yǎng)第5天時，各個多壁碳納米管處理組與對照組差異顯著，其中 50mg/L 多壁碳納來管處理組愈傷組織誘導率達 25% ，而對照組的愈傷組織誘導率僅為 14% 。培養(yǎng)第10天時，僅 50mg/L 多壁碳納米管處理組與對照組存在顯著差異，此時該處理愈傷組織誘導率為 79% ，較對照組提高了17.9百分點。培養(yǎng)15d后，各處理組和對照組之間的愈傷組織誘導率無顯著差異。培養(yǎng) 20d 后，除 25mg/L 多壁碳納米管處理組和對照組各1個組培瓶以及 100mg/L 多壁碳納米管處理組各2個組培瓶內(nèi)因褐化污染現(xiàn)象導致死亡外，其余每個組培瓶內(nèi)草莓植株均有愈傷組織形成，且部分組培瓶內(nèi)草莓植株不定根誘導分化形成。

不同多壁碳納米管培養(yǎng)基對草莓植株不定根誘導率見圖2。培養(yǎng)第20天時， 50mg/L 多壁碳納米管處理組的不定根誘導率為 6.9% ，而對照組的不定根誘導率僅為 1.4% ，兩注： ? 表示與對照組相比差異顯著（ ?-0.05 ）者之間存在顯著差異。培養(yǎng)第30天后，各個處理組和對照組之間的不定根誘導率無顯著差異。培養(yǎng)第50天時，各個處理組和對照組不定根誘導率均達 85% 以上，部分瓶內(nèi)草莓脫毒苗的不定根長度已經(jīng)達到組培瓶底，開始出現(xiàn)環(huán)繞現(xiàn)象。

圖1不同多壁碳納米管培養(yǎng)基草莓植株愈傷組織誘導率Fig.1Callusinduction rateof strawberriesin different multi-walledcarbonnanotubemediums

Note： * indicated significant difference compared with CK（ Plt; 0.05）.

注： 表示與對照組相比差異顯著（ Plt;0.05 ）°

Note：*indicated significant difference compared with CK（ Plt; 0.05）.

圖2不同多壁碳納米管培養(yǎng)基草莓植株不定根誘導率

Fig.2Adventitiousrootinductionrate of strawberriesin different multi-walled carbon nanotube mediums

2.2脫毒苗生長指標不同多壁碳納米管培養(yǎng)基對草莓脫毒苗生長的影響見表1。其中， 50mg/L 多壁碳納米管處理組在草莓脫毒苗高度上與對照組呈顯著差異，平均高度為10.32cm ，較對照組提高了 27.1% 。 100mg/L 多壁碳納米管處理組在草莓脫毒苗根部重量上與對照組呈顯著差異，根部平均重量為 4.70g ，較對照組提高了 94.2% 。在植株總重量和葉片重量方面，各個處理和對照組之間未表現(xiàn)出顯著差異。

2.3不定根根系掃描觀測通過植物圖像分析儀掃描不定根根系，結果表明，不同多壁碳納米管培養(yǎng)基對草莓脫毒苗不定根發(fā)育的影響見表2。其中，25和 50mg/L 多壁碳納米管處理組與對照組的不定根總長度差異顯著，而 100mg/L 多壁碳納米管處理組與對照組的脫毒苗不定根總長度未呈顯著差異。在不定根總體積方面， 50mg/L 多壁碳納米管處理組與對照組存在顯著差異。各個處理之間不定根平均直徑未表現(xiàn)出顯著差異。在不定根根尖數(shù)方面，各個多壁碳納米管處理組均與對照組存在顯著差異。綜合分析， 50mg/L 多壁碳納米管處理的效果最佳，相較于對照組，其不定根平均總長度、總體積和根尖數(shù)分別提高了 83.4% 、 163.8% 和70.1% 。

表1不同多壁碳納米管培養(yǎng)基對草莓脫毒苗生長的影響

Table1Effects ofdiferentculture mediums byusingmulti-waledcarbon nanotubesonstrawberryvirus-free seedlinggrowth

注：同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（ 。 Note：Different lowercase letters indicated significant difference between treatments（ Plt;0.05） ！

表2不同多壁碳納米管培養(yǎng)基對草莓脫毒苗不定根發(fā)育的影響

注：同列不同小寫字母表示不同處理間存在顯著差異（ 。Note：Different lowercase letter indicated significant difference between treatments（ Plt;0.05） ：

2.4不定根形態(tài)結構觀察在顯微鏡觀察下，多壁碳納米管培養(yǎng)基的草莓脫毒苗根系表面和多壁碳納米管培養(yǎng)基的草莓脫毒苗根系橫截面微觀結構見圖3和圖4。部分不定根組織結構切片見圖3，多壁碳納米管吸附于根系表面，形成團聚形狀。而通過包括圖4在內(nèi)的多組各個處理不定根橫截面微觀結構的石蠟切片觀察，未發(fā)現(xiàn)有多壁碳納米管直接進入草莓脫毒苗不定根內(nèi)部形成團聚形狀的情況

圖3多壁碳納米管培養(yǎng)基的草莓脫毒苗根系表面

注：A. 100mg/L 多壁碳納米管處理組;B.對照組。

Note： A. 100mg/L CNTs treatment group;B. CK group.

2.5煉苗與移栽草莓脫毒苗生根培養(yǎng)50d后，除前期組培瓶內(nèi)因污染導致植株死亡外，其余各個處理脫毒苗生根率均達 100% 。當瓶內(nèi)草莓脫毒苗不定根接觸瓶底時（圖5A），開始煉苗準備移栽。各處理組與對照組的脫毒組培苗移栽成活率均大于 95% ，無顯著差異。多壁碳納米管培養(yǎng)基培育的草莓脫毒苗后續(xù)生長表現(xiàn)正常（圖5B）。

3結論與討論

該研究中，多壁碳納米管培養(yǎng)基在培養(yǎng)初期對草莓脫毒植株愈傷組織的誘導形成影響較大，這與Gaafar等[12關于荷荷巴苗體外培養(yǎng)的研究結果近似，碳納米管提高了植株愈傷組織倍增率。關于不定根誘導方面，該試驗結果推測草莓植株不定根誘導的前期表現(xiàn)受到愈傷組織誘導結果的影響，而根據(jù)不定根根系掃描觀測結果，多壁碳納米管處理對組培脫毒苗的不定根形成產(chǎn)生影響，這與王鴻雪[13]關于碳納米管處理對嘎啦蘋果無菌苗生根試驗的研究結果一致。研究表明在植物組織中添加碳納米管會影響植株丙二醛（MDA）含量，激發(fā)不定根抗氧化酶活性，通過調(diào)節(jié)不定根形成的相關基因表達影響脫毒苗生根。此外，該試驗通過不定根根系掃描觀測，發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管培養(yǎng)基會顯著影響不定根體積和根尖數(shù)的形成，推測在植物組織培養(yǎng)過程中添加多壁碳納來管會誘導脫毒苗不定根分生數(shù)量提升，可使組培瓶內(nèi)植株更加充分利用有限空間，提高組培生產(chǎn)效率，該推論有待進一步驗證。

圖4多壁碳納米管培養(yǎng)基的草莓脫毒苗根系橫截面微觀結構

注： A.25mg/L 多壁碳納米管處理組； B.50mg/L 碳納米管處理組;C. 100mg/L 碳納米管處理組;D.對照組。

Note ： A. 25mg/L CNTs treatment group ;B. 50mg/L CNTs treatment group ;C. 100mg/L CNTs treatment group; D. CK group.

Fig.4Root transection microstructure of multi-walled carbon nanotube mediums on strawberry virus-fre sedlings 注： A.50mg/L 多壁碳納米管處理組草莓脫毒苗煉苗; B.50mg/L 多壁碳納米管處理組草莓脫毒苗移栽容器生長。 Note：A. Strawberry virus-free seedling domestication of 50mg/L MWCNT treatment group;B. Strawberry virus-free seedlings of 50mg/L MWCNT treatment group grew in transplanting container.

圖5多壁碳納米管培養(yǎng)基的草莓脫毒苗煉苗與移栽

關于碳納米管對植物形態(tài)結構影響的研究很多，李佳慧[14]研究碳納米管處理對文心蘭類無菌苗生長的相關機理，結果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加碳納米管的文心蘭無菌苗內(nèi)部或者表面有團聚的碳納米管顆粒出現(xiàn)，且碳納米管進入植株內(nèi)部后影響細胞正常的新陳代謝。Sarikhani等[15]研究了多壁碳納米管對砧木GF677（桃和杏雜交）微體繁殖的影響，透射電鏡（TEM）對生長芽組織進行成像，發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管滲透到植物組織中，影響組培苗增殖和生長速率。但研究發(fā)現(xiàn)碳納米管可穿透細胞壁和細胞膜進入根細胞，通過降低內(nèi)源植物激素的濃度顯著抑制水稻生長[16]。多壁碳納米管處理洋蔥根細胞，會改變細胞形態(tài)結構和破壞膜的完整性，影響細胞線粒體的正常功能[17]。該試驗中，僅觀察到多壁碳納來管吸附于根系表面，未在光學顯微鏡下觀察到多壁碳納米管滲透進入不定根內(nèi)部的團聚形狀，可能與多壁碳納米管外徑長度以及選用的組培培養(yǎng)基類型有關，亟待深入研究。

組培脫毒苗的生根質(zhì)量直接影響移栽馴化的成活率，影響植株的整體品質(zhì)。碳納米管在提高組培苗生根效率方法存在巨大潛力。目前，碳納米管已經(jīng)在多種園藝作物、園林植物和藥用植物的植物組織培養(yǎng)技術中應用[18]。但多壁碳納米管作用于植物組織培養(yǎng)的生根機理尚未研究透徹，需要不斷深入分子生物學研究，才能持續(xù)技術創(chuàng)新，拓寬碳納米材料在植物種苗繁育的應用領域。

參考文獻

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