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AGCMethodCombedwithDerivatzationandInternalStandardfortheDeterminatonoftheFattcidsinRefinedPerilaSeed Oil

HAO Jian-xin1，2，HUANG Yu-yao1，LU Li^α et al（1. Guangzhou Heyi Medical Technology Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong 510970; Sichuan Haoyun Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangyuan，Sichuan 628017）

AbstractObjective]ToestablishaGCmetodcombinedwithdrivatiationandtealstandardforthedeteminationoffatyacidsinr finedperllasdilMetdTidpillseedilsaplewaspreparedyethsterifationwiheptadeaicacidsite nalstandard，andnalydygilentcapilarycolunDB-waouledwithameiozatodetetorFD）．Resultelineaelatip of palmitic acid，steraric acid，oleic acid，linoleic acid and ∝ -linolenic acidwas good（ R²?0 .9990）within the range of O.O31 92- 0.319 20，0.010 68-0.106 80，0.078 40-0.78400，0.0768-0.768 00 and 0.30000-3.000000mg/mL ，respectively. The precisions and recoveries were up to the mustard，and the contents of the fatty acids were 5. 98% ， 1.87% ， 15. 1% ， 14.6% and 53.9% ，respectively. [Conclusion]Tismetodwasuratefothedeterinationoffivetycidsinefidperillseedoilandwouldbeusedasafective method for quality control and function evaluation of perilla seed oil.

KeyWordsPerilla seed oil;Fatty acid;Content;GC;Internal standard;Derivatization

紫蘇[Perilla frutescens（L.）Britt.]，古名荏，又名引子、白蘇、蘇子、蘇草、蘇麻、香蘇、桂荏等，屬于唇形科紫蘇屬的一年生草本植物[1]。這種植物在中國有著悠久的歷史，是一種既可以食用也可以藥用的植物，被國家衛(wèi)生部列入首批既是食品又是藥品的名單中[2]。紫蘇的成熟果實即紫蘇子，具有多種藥用功效，包括平喘、化痰、止咳、潤腸通便等[3]。紫蘇子中提取的油脂即蘇子油，在我國有著長久的食用和藥用傳統(tǒng)，早在5世紀的《神農(nóng)本草》中已有關于蘇子油的記載，指出這種油食之無副作用，被列為上品[4]。蘇子油具有抗炎、抗過敏、降血糖、降血壓、抗血栓等作用，在防治高脂血癥和心腦血管疾病以及對糖尿病患者的營養(yǎng)治療中表現(xiàn)出潛在優(yōu)勢而備受關注[5-10]。蘇子油的營養(yǎng)性和藥理活性主要依賴于其優(yōu)質的脂肪酸組成，其富含多種不飽和脂肪酸，特別是 ω-3 系列中的 α- 亞麻酸，其含量在 51.92%～698% ，這一比例在各類植物油中是相當高的。此外，蘇子油中還含有油酸、亞油酸、硬脂酸、棕櫚酸等其他脂肪酸[7，1]。目前針對蘇子油脂肪酸組成分析的報道較多，但主要是測定其脂肪酸的相對組成或單一成分[12-14]，該研究建立一種衍生化氣相色譜內(nèi)標法同時測定蘇子油中各種脂肪酸的準確含量，為蘇子油脂肪酸成分的質量控制及功能評價提供有效的分析手段。

1材料與方法

1.1儀器與試藥Agilent7890A氣相色譜儀（配FID檢測器）；蘇子油購自吉林省百利生物科技有限公司； α- 亞麻酸、油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、十七烷酸、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯、花生酸甲酯、山崙酸甲酯對照品購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；三氟化硼乙醚溶液購自北京長陽化工廠；甲醇、正己烷為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2精制蘇子油的制備蘇子油的組成成分較為復雜，除了含量大于 98% 的甘油三酯外，還含有游離脂肪酸、磷脂、?；视腿?、脂溶性維生素、蠟、金屬、色素、氣味成分、生育酚、植物甾醇等微量組分[15]。油脂的精制過程即是針對這些微量組分，通過一系列的工藝手段實現(xiàn)無益組分的去除或限量，從而提高油脂的純度，實現(xiàn)油脂品質的提升[16]。為了提高蘇子油的品質，該研究參照油脂除雜純化的傳統(tǒng)工藝過程，將購置的蘇子油經(jīng)過脫膠、脫酸、脫色、脫臭、脫蠟處理后得到精制蘇子油[16]

1.3 試驗方法

1.3.1精制蘇子油中脂肪酸的組成分析。

1.3.1.1氣相分析條件。氣相色譜柱AgilentDB-wax0 30m×0.32mm，0.25μm） ，氫火焰離子化檢測器（FID），檢測器溫度 270‰ ，進樣口溫度 260‰ ，柱前壓 68.95kPa ，分流比 30：1 ;柱升溫程序為 230°C 維持 11min ，以 升溫至 250^qC ，維持 10min 。

1.3.1.2脂肪酸甲酯混合對照液的配制。為分析精制蘇子油所含脂肪酸成分的種類，將月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯 ?_?α^- 亞麻酸甲酯、花生酸甲酯和山崙酸甲酯這9種對照品分別精確稱量25.00mg ，然后分別放入 25mL 容量瓶中，并使用正己烷作為溶劑定容，混勻；精密量取 1.00mL 于 10mL 容量瓶中，用正己烷定容，混勻，配制各種脂肪酸甲酯濃度均為 0.10mg/mL 的混合對照液。

1.3.1.3供試品溶液的制備。取 0.1g 精制蘇子油放入50mL 錐形瓶內(nèi)，隨后加人 4mL0.5mol/L 的氫氧化鉀甲醇溶液。將錐形瓶置于 65^°C 的水浴中進行 10min 的回流加熱，讓其自然冷卻。接著加入 2mL 15% 的三氟化硼甲醇溶液，再次在 65^°C 水浴中回流加熱 10min ，冷卻后加入 4mL 正己烷并充分振蕩混合。加入 10mL 飽和氯化鈉溶液進行洗滌，搖勻后靜置以分層，隨后取出上層液體。用 2mL 水重復洗滌上層液體3次，之后通過無水硫酸鈉進行干燥處理，即可得到所需的提取物。

1.3.1.4脂肪酸組成分析。將脂肪酸甲酯對照液和精制蘇子油樣品溶液分別注入氣相色譜儀中，每次進樣 1μL ，并記錄色譜圖。

1.3.2 精制蘇子油中脂肪酸的定量分析。

1.3.1氣相分析條件。柱溫為 230^qC 維持 11min ，柱前壓為 137.90kPa ，其他條件同“1.3.1.1”。

1.3.2脂肪酸混合對照儲備溶液和內(nèi)標溶液的配制。取適量棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和 ∝ -亞麻酸的對照品，準確稱量后放入 25mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，確保溶液均勻，從而制備出含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和 α- 亞麻酸的混合對照儲備液，其質量濃度分別為0.31920、0.10680.0.78400.0.76800 和 3.000 00mg/mL 。選取適量的十七烷酸對照品，經(jīng)過精確稱量后加至 50mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，配制成十七烷酸質量濃度為0.514 0mg/mL 的內(nèi)標溶液。

1.3.3供試品溶液的制備。稱量大約 0.1g 的精制蘇子油，精密稱定，然后將其放入 50mL 的燒瓶內(nèi)，并加入 4mL 0.5mol/L 的氫氧化鉀甲醇溶液，充氮氣后 65^°C 水浴加熱攪拌回流 10min 至油滴完全消失，放冷，轉移至 50mL 容量瓶中，用甲醇 5mL 潤洗燒瓶3次至轉移完全，甲醇稀釋定容，搖勻，制備皂化液。精密量取上述溶液 1.00mL 置于 20mL 具塞玻璃試管中，精密加入內(nèi)標溶液 1.00mL ，充分混合后，向其中添加 2mL 含 15% 三氟化硼的甲醇溶液，接下來在65^°C 的水浴中進行 5min 的甲酯化處理。冷卻至室溫后，加入 2mL 正己烷并徹底混合，接著加人 2mL 飽和氯化鈉溶液并再次混合，讓混合物靜置直至出現(xiàn)明顯的分層。之后，用5mL 水清洗分離出的上層液體。最后，將上層液體通過添加 0.4g 無水硫酸鈉來進行干燥處理即得精制蘇子油的甲酯化溶液。

1.3.4專屬性試驗。分別制備精制蘇子油、內(nèi)標、精制蘇子油和內(nèi)標的甲酯化溶液以及空白溶劑，分別取 1μL 進樣按照\"1.3.1\"氣相分析條件進行分析，記錄色譜圖。

1.3.5標準曲線的繪制。依次精密量取脂肪酸混合對照儲備溶液 0.50，1.00，00，3.00，4.00mL 置 5mL 容量瓶中，加甲醇稀釋定容，搖勻，與混合對照儲備液一同制成系列混合對照溶液。依次精確測量 1.00mL 的混合對照溶液，并將其轉移至 20mL 容量的密封玻璃試管內(nèi)，按照“1.3.3”項進行“精密加入內(nèi)標溶液 1.00mL ”后操作，并依次取 1μL 進樣分析。以脂肪酸對照品溶液質量濃度（ mg/mL ）為橫坐標（X） ，以對照品與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標（Y），繪制標準曲線。

1.3. 6 精密度試驗。

（1）測量精密度。分別取精制蘇子油溶液、內(nèi)標溶液各1μL 進樣，連續(xù)測定6次，按照\"1.3.1”氣相分析條件進行分析，分別記錄棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸 ?_?α^? -亞麻酸和內(nèi)標峰的峰面積，并計算各組分峰面積與內(nèi)標峰面積比值的相對標準偏差（RSD）。

（2）方法精密度。取同一批精制蘇子油6份，每份約 ，精密稱定，分別制備供試品溶液。分別取供試品溶液1μL ，按照\"1.3.1”氣相分析條件進行分析，分別記錄棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和 ∝- 亞麻酸的峰面積。

1.3.7加樣回收率試驗。取已測定含量的精制蘇子油約0.1g ，精密稱定，制備成皂化液。精密量取9份 1.00mL 的皂化液，每3份為一組分別精確加入低、中、高3種濃度的混合對照品溶液 1.00mL ，使加入的各成分濃度約為本底濃度的 50% ） 100% 和 150% ，按照“1.3.3”項進行“精密加入內(nèi)標溶液 1.00mL^′ 后操作，并依次進樣測定，根據(jù)測得量和加入量計算回收率。

1.3.8穩(wěn)定性試驗。制備精制蘇子油供試品溶液1份，在 0.2，4，6，8，10，12，24h 分別取精制蘇子油溶液和內(nèi)標溶液各 1μL 進樣，按照\"1.3.1”氣相分析條件進行分析，記錄棕櫚酸、硬脂肪、油酸、亞油酸、 α- 亞麻酸和內(nèi)標峰的峰面積。

1.3.9樣品測定。分別取精制蘇子油和蘇子油各3份，按照\"1.3.3”方法制備供試品溶液并進行測定，分別計算精制蘇子油和蘇子油中的脂肪酸含量。

2 結果與分析

1脂肪酸組成分析從圖1可以看出，精制蘇子油主要含有5種脂肪酸，根據(jù)脂肪酸甲酯混合對照液圖譜及其保留時間分析確定這5種脂肪酸依次為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸 ?^α- 亞麻酸。

2精制蘇子油中脂肪酸的定量分析

1專屬性試驗。如圖2所示，表明空白溶劑對蘇子油的5種脂肪酸和內(nèi)標的測定無干擾，蘇子油的5種脂肪酸與內(nèi)標相互無干擾，方法專屬性良好。

2標準曲線的繪制。以脂肪酸對照品溶液質量濃度（ mg/mL ）為橫坐標 （X） 、對照品與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，曲線回歸方程見表1。結果表明棕櫚注：1.棕櫚酸；硬脂酸；3.油酸；4.亞油酸；5. ∝ -亞麻酸。

圖1精制蘇子油中主要脂肪酸的氣相色譜圖

Note：1.Palmitic acid; Steraric acid;3.Oleicacid;4.Linoleic acid; 4. α -linolenicacid.

酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和 α- 亞麻酸分別在 0.03192～ 0.319 20、0.01068～0.10680、0.07840～0.784 00、0.076 80～0.76800和 0.30000～3.000000mg/mL 與峰面積比值呈良好線性關系（ R²≥0.9990 。

3 精密度試驗。

3.1測量精密度。按照“1.3.6\"項下操作，結果發(fā)現(xiàn)棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和 α- 亞麻酸的峰面積與內(nèi)標峰面積比值的RSD分別為 0.34%0.0.24%0.14%0.0.10% 和0.23% ，表明測量精密度良好。

圖2空白溶劑（a）、內(nèi)標甲酯化溶液（b）、精制蘇子油的甲酯化溶液（c）和精制蘇子油加內(nèi)標的甲酯化溶液（d）的氣相色譜圖Fig.The GCcromatogamsofsolvet（a）interaltadardsutionb）fiedperilsdoilsolutio（c）andrefinedperildoplus internal standard solution（d）

3.2方法精密度。按照“1.3.6\"項下操作，結果發(fā)現(xiàn)棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和 ∝ -亞麻酸峰面積的RSD分別為 1.62%、1.60%、1.41%、1.42%、1.29% ，表明方法的精密度良好。

4加樣回收率試驗。按照\"1.3.7\"項下操作，結果如表2所示，表明該加樣回收率試驗符合方法學要求。

表15種脂肪酸含量測定的標準曲線（ n=6

Table1 The results of regression equation （n=6）

5穩(wěn)定性試驗。按照“1.3.8”項下操作，對5種脂肪酸（棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和 ∝ -亞麻酸）的峰面積與內(nèi)標峰面積的比值進行重復性分析，這些比值的RSD見表3。棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和 α- 亞麻酸的峰面積與內(nèi)標峰面積比值的RSD分別為 0.21%0.0.48%0.15%0.0.21% 和 0.18% ，表明供試品溶液在 24h 內(nèi)穩(wěn)定。

6樣品測定。分別取精制蘇子油和未精制蘇子油各3 份，按照“1.3.3”項制備供試品溶液并進行測定，分別得到 精制蘇子油和未精制蘇子油中脂肪酸含量。由表4可知，精 制蘇子油中棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和 α- 亞麻酸的含 量分別為 5.98%1.87%15.1%14.6% 和 53.9%（m/m） ；與 未精制蘇子油相比，棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸的含量均 略有提高，表明蘇子油在精制過程中所含的雜質成分得到去 除，脂肪酸甘油酯的純度得到提升，品質得以改善；而 α- 亞 麻酸的含量則略有降低，表明在精制過程中 ∝- 亞麻酸發(fā)生 轉化或降解，可能由于 α- 亞麻酸在植物油脂肪酸中不飽和度最高且較不穩(wěn)定所致。

表25種脂肪酸的加樣回收率試驗結果

表3樣品穩(wěn)定性試驗結果

表4蘇子油中5種脂肪酸含量測定結果

3結論與討論

脂肪酸成分是蘇子油的功能性物質基礎，因此對其進行準確的組成和定量分析是十分有必要的。該研究首先通過植物油常含有的各種脂肪酸甲酯對照品確定了蘇子油中主要含有5種脂肪酸，分別是棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和α -亞麻酸。而后建立了同時定量分析蘇子油中5種脂肪酸含量的衍生化氣相色譜內(nèi)標法，該方法經(jīng)方法學驗證準確性高、重復性好，符合測定要求。氣相色譜法是目前最常用于測定油脂脂肪酸成分的分析方法，與液相色譜法相比，其靈敏度更高、分離效果更好、分析時間更短，提高了分析的準確性和效率。油脂脂肪酸成分分析的衍生化前處理方法中，甲酯化是應用最多的。為了避免甲酯化程度和甲酯化物穩(wěn)定性對脂肪酸成分含量測定準確性的影響，該研究采用十七烷酸作為內(nèi)標物，并且在樣品制備過程中將十七烷酸加至蘇子油的皂化液中參與甲酯化反應過程，以校正衍生化過程引起的含量測定偏差，使得測定結果更準確。結果表明精制蘇子油中 "多不飽和脂肪酸— α?α∝ 亞麻酸含量最高，可達53.9% ;其次是 ω_ω∞-6 多不飽和脂肪酸——亞油酸和單不飽和脂肪酸——油酸，含量分別為 14.6% 和 15.1% ;含量較低的為飽和脂肪酸—棕櫚酸和硬脂酸，含量分別為 5.98% 和1.87% ，總脂肪酸含量達 91.45% ，這一結果與周曉晶等的研究結果一致，驗證了蘇子油脂肪酸組成的優(yōu)越性。對比蘇子油精制前后脂肪酸含量，精制蘇子油中 α- 亞麻酸含量略有降低，可能由于該脂肪酸不飽和程度較高，精制過程中損失量較大，而其他脂肪酸和總脂肪酸含量略有升高，從側面反映出油脂純度得到了提升。該方法準確可靠，能夠作為蘇子油脂肪酸成分質量控制及功能評價的有效手段。

參考文獻

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