過氧亞硝基陰離子（ 0NOO^- ）是一種重要的活性氧/活性氮（ROS/RNS）物質(zhì)，在生物體內(nèi)由一氧化氮（NO·）和超氧陰離子 （?0₂^-） 化合生成[1-2]，具有強(qiáng)氧化性，參與許多生理代謝過程。當(dāng)生物體內(nèi)ONOO-濃度過量時(shí)，不僅會(huì)誘導(dǎo)多種生物靶點(diǎn)的不可逆損傷，還可能介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，從而破壞細(xì)胞和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[3]。研究表明， 0NOO^- 不僅是導(dǎo)致細(xì)胞毒性的重要介質(zhì)，還與多種疾病相關(guān)，包括神經(jīng)退行性病變、慢性關(guān)節(jié)炎、炎癥反應(yīng)、多種神經(jīng)功能障礙、免疫系統(tǒng)異常、循環(huán)系統(tǒng)衰竭以及惡性腫瘤等[46]。另一方面，環(huán)境污染（如微塑料和 Hg²⁺ 污染）會(huì)刺激人體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致ONOO激增，對機(jī)體造成一定程度的損害[7-8]。因此，開發(fā)能有效監(jiān)控 0NOO^- 實(shí)時(shí)變化的檢測方法尤為重要?；谛》肿訜晒馓结樀臒晒鈾z測技術(shù)由于高靈敏度、非侵人性和高時(shí)空分辨率而成為監(jiān)測生物活性物質(zhì)的有力工具[9-11]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道了一些可以用于 0NOO^- 檢測的小分子熒光探針[12-14]。Bruemmer等[15]開發(fā)了一種具有高特異性的 0NOO^- 熒光探針，成功用于干擾素刺激的肺上皮細(xì)胞中 0NOO^- 的監(jiān)測，但該探針存在Stokes位移小和發(fā)射波長短等缺點(diǎn)。因此，開發(fā)靈敏度高、響應(yīng)速度快、具有大Stokes位移的ONOO熒光探針，對于生物過程中ONOO的動(dòng)態(tài)變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測以及環(huán)境污染物造成的氧化應(yīng)激過程的研究具有重要意義。

本研究分別以具有優(yōu)良光學(xué)性能的喹啉和二苯基麟酰胺作為熒光母體骨架和識(shí)別基團(tuán)，構(gòu)建了一種“ON-OFF”型熒光探針QFPD。此熒光探針可以選擇性識(shí)別 0NOO^- ，同時(shí)伴隨著溶液顏色的明顯變化，可實(shí)現(xiàn)對ONOO-的肉眼識(shí)別。利用此探針成功實(shí)現(xiàn)了HepG2細(xì)胞和Raw 264.7細(xì)胞內(nèi)源性O(shè)NOO°的實(shí)時(shí)監(jiān)控；同時(shí)，利用此探針實(shí)現(xiàn)了微塑料（聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA）和 Hg²⁺ 污染脅迫下細(xì)胞內(nèi)ONOO水平變化的熒光成像監(jiān)測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1. 1 儀器與試劑

NanoDrop 2000/2000C 紫外可見分光光度計(jì)、Vanquish core-LTQ XL液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀和3354 細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國ThermoFisher Scientific 公司）；FL-4700 熒光分光光度計(jì)（日本HTACHI公司）；AVANCEIITM500核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）；FluoViewFV1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）；SC-33610低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器公司）；VS-1300L-U超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

5-甲醛基呋喃-2-硼酸、對溴苯酚和[1，1'-雙（二苯基膦基）二茂鐵]二氯化鈀（ Pd（dppf）Cl₂ 和氨基胍（Aminoguanidine，AG）（上海阿拉丁公司）；2-甲基喹啉、二苯基次麟酰氯、脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）、N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（Phorbol 12-myristate13-acetate，PMA）、2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物（2，2，6，6-Tetramethylpiperidine oxide，TEMPO）和硝普鈉（上海麥克林公司）；碘乙烷和哌啶（美國 Sigma公司）；叔丁基過氧化氫和過氧化氫（ 30% ，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超氧化鉀和三乙胺（安耐吉醫(yī)藥化學(xué)公司）。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

小鼠巨噬細(xì)胞（Raw 264.7）和人肝癌細(xì)胞（HepG2）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海）；青霉素-鏈霉素購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）購自浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.2 探針QFPD的合成

探針QFPD的具體合成路線見圖1。

1.2. 1 化合物1和2的合成

參照文獻(xiàn)[16]合成化合物1，無需純化，直接用于下一步反應(yīng)。

將對溴苯酚（ 1.73g ， 10mmol ）和5-甲醛基呋喃-2-硼酸 （1.678g ！ 12mmol ）溶于 30mL 四氫呋喃中，加人 K₂CO₃ 溶液（ 250mg/mL ， 10mL ）攪拌均勻。隨后加入催化劑 Pd（dppf）Cl₂（75mg，0.1mmol） ，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于 60^°C 回流反應(yīng) ^4h 后，冷卻至室溫（ 25^°C ，用飽和 ΔNaCl 溶液洗滌，乙酸乙酯萃取。減壓濃縮后，粗產(chǎn)物通過柱色譜法以正已烷-乙酸乙酯（20：1，V/V）為洗脫劑進(jìn)一步純化，得到淡黃色化合物 Ω²（940mg ，產(chǎn)率 50% ）。 ¹H NMR（ 500MHz ，DMSO） δ=10.05 （s，1H），9.53 （s，1H），7.72 （d， J=11.4Hz ，2H），

7.61 （d ，J=3.7Hz ，1H），7.06（ d，J=3.7Hz ，1H），6.89 （d， J=8.7Hz ，2H）（見電子版文后支持信息圖S1）。 ¹³C NMR （ 125MHz ， DMSO） δ=177.49 ，159.71，159.59，151.48，127.40，120.22，116.50，107.02（電子版文后支持信息圖S2）。HR-MS（ESI， m/z ）cacld for C₁₁H₈O₃⁺[M+H]⁺：189.0551 ，found： 189.01（電子版文后支持信息圖S3）。

1. 2.2 化合物QFP-OH的合成

將化合物1（ 602mg ， 3.5mmol 和化合物2（ 376mg ， 2mmol 溶于 15mL 無水乙醇中，隨后滴入5滴哌啶，回流反應(yīng) ^1h 后，冷卻至室溫（ 25^°C ），旋蒸除去溶劑后，粗產(chǎn)物通過色譜柱以二氯甲烷-甲醇0 （100：1，V/V） 作為洗脫劑進(jìn)一步純化，獲得紫黑色固體QFP-OH（ 410mg ，產(chǎn)率 60% ）。 ¹H NMR（ 500MHz ， DMSO） δ=8.93 （d， J=9.1Hz ，1H），8.54 （dd， J=9.0 ！ 5.7Hz ，2H），8.31 （ d，J=8.0Hz ，1H），8.23 （d， J=15.2Hz ，1H），8.14 （t， J=8.6Hz ，1H），7.90 （t ，J=7.5Hz ，1H），7.84 （d ，J=8.7Hz ，2H），7.47 （d， J=15.3Hz ，1H），7.36 （d， J=3.6Hz ，1H），7.13 （d， J=3.7Hz ，1H），6.91 （d， J=8.7Hz ，2H），5.11（q， J=7.0Hz ，2H），1.60（t， J=7.2Hz ，3H）（電子版文后支持信息圖S4）。 ¹³CNMR （204號(hào)（ 125MHz ，DMSO） δ=159.44 ，159.14，154.98，150.62，143.57，138.60，135.32，133.61，130.71，129.07，128.12，127.31，123.42，120.98，120.51，119.19，116.47，113.20，108.67，46.68，14.41（電子版文后支持信息圖S5）。HR-MS（ESI， m/z ）cacld for C₂₃H₂₀NO₂⁺ [M]：342.1489，found：342.071（電子版文后支持信息圖S6）。

1.2.3 化合物QFPD的合成

將化合物QFP-OH（ 80mg 0.23mmol 溶于 2mL 無水二氯甲烷中，加入適量三乙胺，在 0^°C 下緩慢滴入二苯基次麟酰氯（ 210μL ， 1.17mmol ），攪拌反應(yīng)1h后，旋蒸除去溶劑得到粗產(chǎn)物，通過色譜柱以二氯甲烷-甲醇（80：1，V/V）作為洗脫劑進(jìn)一步純化，得到橙色固體目標(biāo)物QFPD（ 50mg ，產(chǎn)率 40% ）。 ¹H NMR1 500MHz ， DMSO） δ=8.76 （ d，J=9.0Hz ，1H），8.56 （d， J=9.0Hz ，1H），8.39 （d， J=15.2Hz ，1H），8.02 （d， J=9.0Hz ，1H），7.98＼～7.92（m，4H），7.85（t ，J=7.9Hz ，1H），7.79 （d， J=8.0Hz ，1H），7.59（d， J=7.5 ， 1.3Hz ，2H），7.55 （d ，J=7.3Hz ，3H），7.53＼～7.51 （m，3H），7.39＼～7.33 （m，2H） ），7.30＼～7.23（m，3H），6.45 （d， J=3.6Hz ，1H），5.11（q， J=7.0Hz ，2H），1.63 （t， J=7.3Hz ，3H）（見電子版文后支持信息圖S7）。 ¹³C NMR （ 125MHz ， CDCl₃ ） δ=157.62 ，154.66，151.75，151.69，151.02，143.71，138.00，135.04，134.76，132.80，132.78，131.85，131.77，131.41，131.32，131.09，130.38，129.99，128.87，128.76，128.40，127.98，127.87，127.72，126.50，125.38，123.95，121.63，121.47，121.43，117.84，112.46，109.22，46.99，14.20（電子版文后支持信息圖 S8）。HR-MS（ESI， m/z ）cacld for C₃₅H₂₉NO₃P⁺ [M]：542.1880，found：542.303（電子版文后支持信息圖S9）。

1.3 性能測試

取適量探針QFPD溶于二甲基亞砜，配制成 10mmol/L 探針儲(chǔ)備液。光譜測試在磷酸鹽緩沖溶液（PBS， 10.0mmol/L ， pH=7.4 ）中進(jìn)行，探針濃度均為 10μmol/L 。其它干擾物（Phe、Ala、Cys、Pro、Gly、GSH、Hcy、Se、Thr、Asn、Val、Tyr、His、VC、 ΔS^2- 、 S₂O₃^2- 、 SO₃^2- 、 SO₄^2- 。、 HS^- 、 HSO₃^- 、 HSO₄^- 、 NO₂^- 和NO₃^- ）均用去離子水溶解，制備成 10mmol/L 母液。 0NOO^- 溶液根據(jù)文獻(xiàn)[17]中的方法進(jìn)行配制。在室溫條件下采用紫外可見吸收光譜儀和熒光光譜儀測試其光譜， λ_ex/λ_em=450nm/580nm ，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度設(shè)置為 20nm 。

1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

選用小鼠巨噬細(xì)胞（ Raw264.7 細(xì)胞）和人肝癌細(xì)胞（ 細(xì)胞）作為模型細(xì)胞，評估QFPD的細(xì)胞毒性。將Raw264.7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞接種于含有 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在 37^°C 、 5% CO₂ 、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24～48h ，直至細(xì)胞融合度達(dá)到 80%～90% [18]。

采用CCK-8法檢測探針的細(xì)胞毒性。分別將Raw264.7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞以每孔 5×10⁵ 個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，每孔加入 100μL 細(xì)胞懸液和培養(yǎng)基混合液，在 37^°C 、 5%CO₂ 的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng) 24h 添加不同濃度梯度的探針QFPD（0、5、10、15、20和 25μmol/L ），每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng) 12h 后，移去培養(yǎng)基，各孔用無菌PBS緩沖液輕柔洗滌細(xì)胞1次，然后加入 100μL 培養(yǎng)基（含 10% 的CCK-8溶液），繼續(xù)培養(yǎng) 1～4h 。采用酶標(biāo)儀測定各孔在 450nm 波長處的吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞存活率[19]：

式中， A_s 、 A_c 和 ∣A_b 分別代表實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和空白組的吸光度值。

1.5 細(xì)胞成像

將Raw264.7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞按照1.4節(jié)的實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng) 24～48h 后，接種于共聚焦培養(yǎng)皿中（ 7×10⁵ cell/dish），在 37^°C 、 5%CO₂ 的條件下繼續(xù)培養(yǎng) 24h 。

（1）探針QFPD對Raw264.7細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞內(nèi)源性 0NOO^- 的熒光成像共分為6組：第1組，向細(xì)胞中加入探針QFPD（ 10μmol/L ），在 37^°C 下培養(yǎng) 20min ；第2組，向細(xì)胞中加入PMA（ 2μg/mL ，在37^°C 下培養(yǎng) 3h ，加入探針QFPD（ 10μmol/L 繼續(xù)培養(yǎng) 20min ；第3組，向細(xì)胞中加入LPS（ 1.5μg/mL 培養(yǎng) 12h 后，再加入探針QFPD（ 10μmol/L 培養(yǎng) 20min ；第4組，將細(xì)胞與NAC（ 1mmol/L ）共同培養(yǎng)60min ，再加入探針QFPD（ 10μmol/L ）繼續(xù)培養(yǎng) 20min ；第5組，將細(xì)胞用AG（ 1mmol/L ）預(yù)處理 3h ，然后加入探針QFPD（ 10μmol/L 培養(yǎng) 20min ；第6組，將TEMPO（ 300μmol/L ）加入細(xì)胞中培養(yǎng) 30min 后，加入探針QFPD（ 10μmol/L 培養(yǎng) 20min 。

（2）PMMA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生 0NOO^- 的熒光成像將HepG2細(xì)胞與不同濃度PMMA（5、10、20、和 50μg/mL ）共培養(yǎng) 24h ，再加入探針QFPD（ 10μmol/L） 繼續(xù)培養(yǎng) 20min 。

（3） Hg²⁺ 脅迫HepG2細(xì)胞產(chǎn)生 0NOO^- 的熒光成像設(shè)計(jì)2組實(shí)驗(yàn)：第1組為 Hg²⁺ 脅迫時(shí)間對細(xì)胞內(nèi) 0NOO^- 濃度波動(dòng)影響實(shí)驗(yàn)，在相同濃度的 Hg²⁺（5μmol/L ）脅迫下，測定不同培養(yǎng)時(shí)間（15、30和60min ）下HepG2細(xì)胞內(nèi) 0NOO^- 的濃度波動(dòng)；第2組為不同濃度 Hg²⁺ 脅迫對細(xì)胞內(nèi) 0NOO^- 濃度的影響，將HepG2 細(xì)胞分別于5、10和 的 Hg²⁺ 中暴露 30min ，加入探針QFPD（ 10μmol/L ）繼續(xù)培養(yǎng) 20min 。

2 結(jié)果與討論

2. 1 探針QFPD對ONOO的光譜響應(yīng)

首先考察了探針QFPD的光譜性質(zhì)。如圖2A和2B所示，探針QFPD在 450nm 處有明顯吸收峰；以 450nm 作為激發(fā)波長時(shí)，在 580nm 處有明顯熒光信號(hào)。當(dāng)探針QFPD與 0NOO^- 反應(yīng)后， 450nm 處的吸收峰紅移至 550nm 處；以 450nm 作為激發(fā)波長時(shí)，體系在 580nm 處的熒光發(fā)生猝滅，這是由于0NOO^- 的強(qiáng)氧化性引起識(shí)別基團(tuán)磷酰胺鍵發(fā)生特異性斷裂[20]。考察了QFPD對不同濃度 0NOO^- 的響應(yīng)時(shí)間（圖2C），發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度的降低速率與 0NOO^- 濃度呈正相關(guān)，并且在 10min 左右達(dá)到最低值，表明QFPD 對 0NOO^- 具有良好的響應(yīng)，且響應(yīng)速度較快。上述結(jié)果表明，探針QFPD對 0NOO^- 具有良好的熒光響應(yīng)，且具有較大的Stokes位移（ 130nm ）。探針QFPD與其它探針的性能比較結(jié)果見電子版文后支持信息表1。

2.2pH值對探針QFPD識(shí)別ONOO的影響

考察了 pH 值對QFPD-ONOO體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖 2D 。在 pH=4.0～5.0 范圍內(nèi)，體系熒光較強(qiáng)，此時(shí)探針QFPD對 0NOO^- 的響應(yīng)較弱，這可能是因?yàn)?0NOO^- 在酸性條件下易分解，其有效濃度降低，間接影響探針的檢測靈敏度[21]。在 pH=6.0～10.0 范圍內(nèi)，QFPD 對 0NOO^- 的響應(yīng)較強(qiáng)，熒光強(qiáng)度降低了數(shù)十倍。

2.3 探針QFPD對ONOO的滴定實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，檢測QFPD探針對不同濃度 0NOO^- 的熒光響應(yīng)。如圖3所示，在PBS（ 10.0mmol/L ， pH=7.4 體系中，隨著 0NOO^- 濃度 （0～20μmol/L ）不斷增大，探針在 580nm 處的熒光強(qiáng)度逐漸下降直至趨于平緩。在 1.4～12μmol/L 濃度范圍內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度與 0NOO^- 濃度具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為 y=-64.08x+927.34 R²=0.9932 ），檢出限（LOD， 3σ/k 為 1.37μmol/L 。

2.4探針QFPD對ONOO的選擇性和抗干擾能力

選擇性是評價(jià)探針性能的重要指標(biāo)之一。選擇常見的陰離子、氨基酸和活性氧物種作為干擾物質(zhì)進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖4。當(dāng)體系中存在上述干擾物質(zhì)時(shí)，未對探針識(shí)別 0NOO^- 產(chǎn)生明顯影響，表明

探針QFPD對ONOO具有良好的選擇性。

2.5 探針QFPD對HepG2細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)

CCK-8細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針QFPD濃度低于 25μmol/L 時(shí)，HepG2細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞的存活率均高于 90% （圖5），表明探針QFPD具有良好的細(xì)胞相容性，并且對這兩種細(xì)胞具有較低的細(xì)胞毒性。鑒于QFPD在低濃度下展現(xiàn)出的低毒性和良好的生物相容性，選擇 10μmol/L QFPD開展后續(xù)的細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。

2.6 探針QFPD對細(xì)胞內(nèi)源性O(shè)NOO-的原位成像

鑒于探針QFPD在體外的良好光學(xué)特質(zhì)，考察了其應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)ONOO原位成像的可行性，結(jié)果見圖6。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Raw264.7細(xì)胞與 10μmol/L 探針QFPD共同孵育 20min 后，細(xì)胞內(nèi)顯示較為明顯的黃色熒光信號(hào)（圖6B）。有研究表明，LPS 和PMA 能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生 0NOO^-[22] ，因此，向細(xì)胞內(nèi)分別加入PMA（ 5μg/mL ）和LPS（ 1.5μg/mL ），與細(xì)胞共孵育一定時(shí)間后，再分別向細(xì)胞內(nèi)加入探針QFPD0 10μmol/L 孵育 20min ，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)顯著降低（圖6C和圖6D），說明PMA和LPS誘導(dǎo)下細(xì)胞內(nèi)的 0NOO^- 顯著增加。為了進(jìn)一步驗(yàn)證探針QFPD是否與 0NOO^- 發(fā)生反應(yīng)，使用NAC（ 1mmol/L 與細(xì)胞共孵育1h，再加入QFPD（ 10μmol/L 共孵育 20min ，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度顯著增加（圖6E），這是由于NAC作為一種高效的ROS清除劑，減少了 ?0₂^- 與NO·的生成量[23]，從而使細(xì)胞內(nèi) 0NOO^- 含量顯著降低。同時(shí)，分別將一氧化氮合酶抑制劑AG（ 1mmol/L ）和自由基清除劑TMEPO（ 300μmol/L ）與細(xì)胞共孵育一定時(shí)間后，再與探針孵育 20min ，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度也顯著增強(qiáng)（圖6F和6G），進(jìn)一步證實(shí)了QFPD可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi) 0NOO^- 的原位檢測。以HepG2細(xì)胞為模型細(xì)胞開展上述實(shí)驗(yàn)，得到了與Raw264.7細(xì)胞成像相同的趨勢（圖6H＼～6N），進(jìn)一步證明了探針QFPD可用于靈敏檢測細(xì)胞內(nèi)源性 0NOO^- 濃度變化和原位成像，具有良好的應(yīng)用前景。

考察了微塑料污染對細(xì)胞造成的影響。以不同濃度的PMMA溶液與HepG2細(xì)胞共孵育 24h ，再與探針孵育一定時(shí)間后進(jìn)行成像研究。如圖7所示，隨著PMMA濃度升高（5、10、20和 50μg/mL ），細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)較探針單獨(dú)存在時(shí)逐漸降低，說明在微塑料的刺激下，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致 0NOO^- 濃度激增，有可能損害細(xì)胞正常功能。這也從另一方面驗(yàn)證了探針能夠監(jiān)測到微塑料（PMMA）刺激下體內(nèi) 0NOO^- 濃度水平的波動(dòng)。

目前， Hg²⁺ 污染已成為備受關(guān)注的重金屬污染問題。 Hg²⁺ 具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，可刺激氧化應(yīng)激反應(yīng)，脅迫細(xì)胞產(chǎn)生活性氮物種[24]。本研究設(shè)計(jì)了兩組實(shí)驗(yàn)，以考察探針QFPD用于監(jiān)控 Hg²⁺ 脅迫下細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生 0NOO^- 的能力： （1）Hg²⁺（5μmol/L） 與HepG2細(xì)胞共同孵育不同時(shí)間（15、30和60min ）；（2）不同濃度的 Hg²⁺（5， 10 和 50μmol/L ）對HepG2細(xì)胞短時(shí)間的急性中毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見電子版文后支持信息圖S10。由圖S10A和S10C可見，隨著時(shí)間延長， 細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)顯著降低，表明 Hg²⁺ 能夠刺激細(xì)胞產(chǎn)生 0NOO^- ；隨著 Hg²⁺ 濃度提高， 0NOO^- 的生成量增加，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度逐漸降低（圖S10B和S10D）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，探針QFPD具備實(shí)時(shí)監(jiān)控 Hg²⁺ 脅迫下細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)以及0NOO^- 水平波動(dòng)的能力。本研究為環(huán)境污染物引起的氧化應(yīng)激研究提供了一種新方法，為環(huán)境污染的監(jiān)測和治理提供了新思路。

3 結(jié)論

本研究以喹啉為熒光母體、二苯基麟酰胺為 0NOO^- 特異性識(shí)別基團(tuán)，設(shè)計(jì)開發(fā)了一種具有大Stokes位移（ 130nm 、可特異性識(shí)別 0NOO^- 的熒光探針QFPD。具有強(qiáng)氧化性的 0NOO^- 可觸發(fā)磷酰胺鍵斷裂并導(dǎo)致熒光猝滅，使溶液顏色由黃色變?yōu)樽仙?。此熒光探針具有檢測靈敏度高、選擇性好、pH適用范圍寬和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)。利用QFPD成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)源性 0NOO^- 的原位成像監(jiān)控。此探針也被用于 Hg²⁺ 和微塑料PMMA脅迫下的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過程的監(jiān)控以及細(xì)胞內(nèi) 0NOO^- 水平波動(dòng)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)污染物通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致ONOO水平激增，為相關(guān)環(huán)境污染物的毒理學(xué)研究提供了直接證據(jù)。

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Design， Synthesis and Application of Peroxynitrite Anion Fluorescent Probe with Large Stokes Shift

YANG Xin-Tong1， WANG Xiao-Chun*2， MA Cui-Ping*1， ZHANG Liang-Wei3， CHEN Ling-Xin ^*3

1（College of Biological Engineering， Qingdao University of Science and Technology， Qingdao 266042， China）

2（Liaoning Key Laboratory of Development and Utilization for Natural Products Active Molecules， School of Chemistry and Life Science， Anshan Normal University， Anshan 1140O7， China） 3（Yantai Institute of Coastal Zone Research， Chinese Academy of Sciences， Yantai 264003， China）

AbstractPeroxynitriteanion （ONOO）， which is originatedfrom the reaction of nitric oxide （NO）and superoxide anion （ 0₂^-） ， plays a pivotal role in immune defense and signal regulation. Excessive levels of ONOO may induce the occurrence of various diseases such as Alzheimer's disease，inflammation，cardiovascular disease and cancer， etc. Existing detection methods for ONOO ^- have limitations such as complexity， time consumption， and low cell biocompatibility. In this study，a novel fluorescent probe QFPD was developed using quinoline and diphenylphosphinamide as fluorescent keleton and recognition group，respectively. The strong oxidizing property of ONOO' triggerd the cleavage of phosphoramide bond，leading to fluorescence quenching and a visible color change of the solution from yellw to purple，thereby enabling“ON-OFF” type recognition of ONOO.QFPD exhibited excellent characteristics including good selectivityand high sensitivity in fluorescence detection （Limit of detection of 1.37μmol/L ），large Stokesshift（ 130nm ）， rapid response （1O min），and strong antiinterference ability.Additionally，QFPDdemonstrated good biocompatibilityand could realize real-time dynamic monitoring of endogenous ONOO\". Furthermore， QFPD was successfully applied to environmental toxicology researchby visualizing the oxidative stress effects induced by microplastics polymethyl methacrylate （PMMA）and （20 Hg²⁺ exposure，which might be a novel tool for the mechanism research on oxidative stress associated with microplastic pollution and heavy metal exposure.