中圖分類號：S828 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-4330（2025）05-1286-07

0 引言

【研究意義】豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinere-productiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的，可導(dǎo)致母豬嚴(yán)重繁殖障礙和所有年齡段的豬呼吸窘迫[1]。PRRSV 的暴發(fā)是由于該病毒發(fā)病迅速，傳播速度快，仔豬發(fā)病率和死亡率高[2]。由于快速準(zhǔn)確的檢測PRRSV是預(yù)防和控制PRRS的關(guān)鍵因素之一，因此需要建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本相對較低、適合現(xiàn)場的檢測方法，降低PRRSV傳播的風(fēng)險。【前人研究進(jìn)展】PRRSV基因組的全長為 15.4kb 左右，包含有11個已知的開放閱讀框，PRRSVGP4是由ORF4所編碼的[3]，ORF4編碼的結(jié)構(gòu)蛋白GP4參與病毒感染，高度糖基化，帶有4個N連接糖基化位點(diǎn)，是一個相對保守的高糖基化的結(jié)構(gòu)蛋白[4]GP4蛋白與 GP2a，GP3 這三個N-糖基化蛋白形成三聚體包膜蛋白復(fù)合物，參與病毒的組裝[5.6]GP4是PRRSV復(fù)制和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，且GP4和PRRSV的主要受體之一CD163能夠互相作用[7]，在病毒組裝和釋放過程發(fā)揮重要作用[8]，因此GP4蛋白對于PRRSV檢測都有著舉足輕重的作用。重組輔助擴(kuò)增（recombinase-aidedisothermal amplifi-fication，RAA）作為一種等溫核酸擴(kuò)增的新技術(shù)，資源要求低，只需四種酶在恒溫 37～42^°C 下短時間15～30min 即可完成擴(kuò)增[9]。近年來，基于實(shí)時熒光技術(shù)的RAA/RT-RAA已成功用于SARS-CoV-2^[10] 、鴨圓環(huán)病毒[]、豬流行性腹瀉病毒[12]、豬瘟病毒[13]等多種病毒的快速檢測。【本研究切入點(diǎn)】PRRS是世界范圍內(nèi)最重要的豬類疾病之一，PRRSV感染也會使豬容易被其他病原體繼發(fā)感染[14]。由于目前還沒有有效的方法和藥物來防治PRRSV，因此研究出有效的防控策略是非常重要和迫切的。早期診斷對于PRRS預(yù)防和控制至關(guān)重要，所以開發(fā)一種用于PRRSV檢測的快速、簡單和準(zhǔn)確的現(xiàn)場診斷測定仍然是必要的?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于ORF4基因建立熒光RT-RAA檢測PRRSV的方法，為PRRSV的快速檢測提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1. 1.1 病毒

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine respiratoryandreproductive syndromesvirus，PRRSV）TJM-F92株、R98株、NADC30株、豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）C株、偽狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）Bartha-K61株、豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）LJX株、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissi-ble gastroenteritisvirus，TGEV）Purdue株均保存于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所海南省熱帶繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1. 1.2 臨床樣本

180份血清樣本采集自海南省海口市、臨高縣、瓊中縣等地豬場，由海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所海南省熱帶繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存于 - 80^°C 備用。

1. 1.3 試劑

RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑購自杭州眾測生物科技有限公司;FastPureViralDNA/RNAMiniKit試劑盒購自諾唯贊（Vazyme）公司； ExTaq（2×） ：dNTPMixture、Recombinant RNase Inhibitor、Re-verse TranscriptaseM-MLVDL2，OOO DNAMark-er均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1. 1 核酸的提取

依照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒的操作說明，提取病毒及臨床樣品的核酸，并于 -80^°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成

從NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫下載PRRSVCH-1a株（AY032626）、JXA1株（EF112445）、XH-GD 株（EU624117）、10GZ-GD 株（JX192633.1）、NADC30株（JN654459）、R98株（DQ355796.1）和GM2株（JN662424）等的GP4基因序列通過MegAlign進(jìn)行對比，針對基因序列的保守區(qū)域，應(yīng)用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并在線對設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行BLAST分析。設(shè)計(jì)探針時，探針長度在 46～52nt 之間，共有四個修飾位點(diǎn)，中部位置標(biāo)記一個dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點(diǎn)，THF位點(diǎn)的上游標(biāo)記一個熒光基團(tuán)，下游標(biāo)記一個淬滅基團(tuán)。送生工生物工程（上海）有限公司合成。上述引物對序列為RAA-ORF4-F：5’-TTCGGACAT-CAAAACCAACACCACCG -3’ ;RAA -ORF4 -R：5’- ACTCATCTCGGAAGCATAGAAAAGGCAAG-3';RAA-ORF4探針序列為：5’-TCCCTGGT-GGTCGACCATGTGCGGTTGC（HEX -dT） C（THF）A（BHQ1 - dT） TTCATGACACCTG - C3 Spacer - ，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 130bp 。

1.3 RAA擴(kuò)增體系的建立

按照熒光RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，在反應(yīng)管中加入ABuffer 25.0μL ，上下游引物（ 10μmol/L ）各2μL ，探針 （10μmol/L）0.6μL ，DEPC 水 19μL 混合均勻后加至有反應(yīng)干粉的檢測單管中，加入5.0μL 模板，再向每個檢測單元管蓋上加入5μL BBuffer，蓋上管蓋，上下顛倒充分混勻5～6次，低速離心10s，將上述反應(yīng)管放置于熒光定量PCR儀中， 39^°C 反應(yīng) 20min ，實(shí)時觀察檢測結(jié)果。

1.4 反應(yīng)體系優(yōu)化

為了優(yōu)化反應(yīng)體系內(nèi)引物濃度、探針濃度、樣品添加量及反應(yīng)溫度，在 50μL RAA反應(yīng)體系內(nèi)以PRRSVR98的基因組RNA為模板（濃度為52ng/μL） ，以試劑盒推薦的引物及探針濃度10μmol/L ，將引物對的終濃度配制為 0.3、0.4、0.5 10.6μmol/L 進(jìn)行熒光RT-RAA反應(yīng)，以確定最佳引物濃度；待確定最佳引物濃度后，將探針終濃度配制為 0.1、0.2、0.3 和 0.4μmol/L 進(jìn)行熒光RT-RAA反應(yīng)，以確定最佳探針濃度；待確定引物及探針濃度后，確定最適樣品添加量；全部確定后，以37、39、41和 43^°C 進(jìn)行熒光RT-RAA反應(yīng)，確定最佳反應(yīng)溫度，以DEPC水作為陰性對照。

1.5 敏感性試驗(yàn)

將PRRSVR98的基因組RNA（濃度為 54ng/ μL ），進(jìn)行5倍梯度稀釋，用作熒光RT-RAA敏感性測試的模板，以DEPC水作為陰性對照，以確定熒光RT-RAA方法的最低檢測限。

1. 6 特異性試驗(yàn)

以提取PRRSV、TGEV、CSFV、PEDV、PRV等病毒核酸為模板，應(yīng)用建立的RAA方法進(jìn)行擴(kuò)增，同時以DEPC水做為陰性對照，評價該方法的特異性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

提取臨床樣本RNA，檢測建立的PRRSV熒光RT-RAA方法，同時將樣本RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA用普通PCR方法檢測臨床樣本中PRRSV感染情況，并比較兩者的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

1 反應(yīng)體系優(yōu)化

研究表明，探針終濃度為 0.3μmol/L 的擴(kuò)增曲線最早出峰;進(jìn)一步對熒光RT-RAA反應(yīng)體系的引物濃度進(jìn)行篩選，引物終濃度為 0.5μmol L起峰最快，熒光值最高；進(jìn)一步對樣品添加量進(jìn)行優(yōu)化，樣品添加量為 364ng 起峰最早，擴(kuò)增效率最高；對反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)溫度為 41^°C 起峰最快，達(dá)到閾值的時間最短。圖1～4

注：1：探針終濃度為 0.lμmol/L;2 ：探針終濃度為 0.2μmol L；3：探針終濃度為 0.3μmol/L;4 ：探針終濃度為 0.4μmol/L;5 陰性對照

圖1 PRRSV熒光RT-RAA方法探針濃度優(yōu)化

Fig.1Optimisationofprobe concentrationforPRRSVfluorescent RT-RAAmethods

注：1：引物終濃度為 0.3μmol/L;2 ：引物終濃度為 0.4μmol L；3：引物終濃度為 0.5μmol/L;4 ：引物終濃度為 0.6μmol/L;5 陰性對照

圖2 PRRSV熒光RT-RAA方法引物濃度優(yōu)化

Fig. 2Optimisation of primer concentration forPRRSVfluorescentRT-RAAmethod

注：1：總RNA量為 156ng;2 ：總RNA量為 260ng;3 ：總RNA量為 364ng;4 ：總RNA量為 ：陰性對照Notes：1：156ng oftotalRNA;2： 260ng of totalRNA;3：364ng of total RNA；4：468ngof total RNA；5：negative control

圖3PRRSV熒光RT-RAA方法樣品添加量優(yōu)化

Fig.3Optimisation of sample addition forthePRRSVfluorescenceRT-RAAmethod

2 敏感性試驗(yàn)

研究表明，以PRRSVR98的基因組RNA5倍梯度稀釋液為模板進(jìn)行檢測熒光RT-RAA方法的靈敏度，隨著稀釋度的降低，出峰時間逐漸延長，熒光值梯度降低，最低可以檢出 0.0864ng 總RNA量，而陰性對照熒光信號無明顯變化，該方法具有較高的靈敏度。圖5

圖4 PRRSV熒光RT-RAA方法反應(yīng)溫度優(yōu)化

注：1：反應(yīng)溫度為 37% ；2：反應(yīng)溫度為 39% ；3：反應(yīng)溫度為41% ；4：反應(yīng)溫度為 43% ；5：陰性對照

Notes：1：reaction temperature was 37^°C ；2：reaction temperature was 39^°C ；3：reaction temperature was 41^°C ；4：reaction temperature was 43^°C ；5：negative control

Fig. 4Optimisation of reaction temperature forPRRSVfluorescentRT-RAAmethod

注：1：總RNA量為 54ng;2 ：總RNA量為 10.8ng;3 ：總RNA量為 16ng;4 ：總RNA量為 0.432ng;5 ：總RNA量為0.0864ng;6 ：陰性對照

Notes：1：54ng of total RNA;2：1O.8ng of total RNA;3：16 ng of total RNA;4：0.432ng of total RNA;5：0.086，4ng of total RNA;6：negative control

圖5 PRRSV熒光RT-RAA方法敏感性試驗(yàn)

Fig. 5 PRRSVfluorescentRT-RAA methodsensitivitytest

3 特異性試驗(yàn)

研究表明，用建立的熒光RT-RAA方法對PRRSVNADC3O株、PRRSVTJM-F92株、PRRSVR98株、TGEVPurdue株、CSFVC株、PEDVLJX株、PRVBartha-K61株的核酸為模板進(jìn)行特異性試驗(yàn)，只有PRRSV收集到特異性熒光信號，其他病毒核酸和陰性對照均無熒光曲線，表明建立的方法特異性良好。圖6

圖6 PRRSV熒光RT-RAA方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

注：1：PRRSVNADC3O株；2：PRRSVTJM-F92株;3：PRRSVR98株;4-8：分別為：TGEVPurdue株、CSFVC株、PEDVLJX株、PRVBartha－K61株、陰性對照Notes：1：PRRSV NADC3O strain;2：PRRSV TJM-F92 strain;3：PRRSV R98 strain; 4-8：TGEV Purdue strain，CSFV C strain，PEDVLJX strain，PRV Bartha-K61 strain，negative control，respec-tively

Fig.6PRRSV fluorescent RT-RAA methodspecificitytestresults

研究表明，熒光RT-RAA方法和普通PCR的陽性/陰性樣品分別為76/104和73/107。通過熒光RT-RAA方法檢出76份樣本為陽性而普通PCR結(jié)果卻顯示僅有73份樣本為陽性，檢出104份樣本為陰性而普通PCR結(jié)果卻顯示有107份樣本為陰性。兩種方法之間的符合率為98.3% ，熒光RT-RAA方法檢測PRRSV可應(yīng)用于臨床。表1

表1熒光RT-RAA方法與PCR方法檢測臨床樣本的比較

Tab.1 ComparisonofRT-RAA-LF andPCRmethodsforthedetection of clinical samples

3討論

3.1PRRSV屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，是一種有包膜的單鏈RNA病毒，基因組大小約為15.4kb^[15] 。根據(jù)其遺傳特征，PRRSV可分為兩種基因型：1型（PRRSV-1）和2型（PRRSV-2）[16]。針對 PRRSV 的商業(yè)疫苗目前提供的保護(hù)有限，變異率最高[17]。此方法有可以縮短獲得準(zhǔn)確結(jié)果所需的時間，有助于發(fā)現(xiàn)早期感染PRRSV的豬群，可以更好地制定有效的隔離措施，從而切斷傳播途徑，更好的進(jìn)行治療。

3.2研究針對PRRSVORF4基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了熒光RT-RAA檢測方法，進(jìn)行了條件優(yōu)化以及特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)。熒光RT-RAA檢測可在 41^°C 下用引物和探擴(kuò)增20min ，通過熒光定量PCR儀實(shí)時觀察結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了對PRRSV的快速高效的可視化檢測。該方法具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性，最低可以檢出 0.0864ng 總RNA量，與其他豬病原體也無交叉反應(yīng)。

3.3近年來，開發(fā)出了基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的PRRSV快速檢測方法。與已發(fā)表的王方洲等[18]建立的實(shí)時熒光RPA檢測美洲型PRRSV方法相比熒光RT-RAA方法的溫度更低更好實(shí)現(xiàn)。與已發(fā)表的孫鳳萍等[19]建立的RT-LAMP檢測PRRSV方法相比，熒光RT-RAA方法的檢測時間更短，且不需要設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物。與張森豪等[20]建立的LF－RPA 檢測 PEDV 相比，熒光RT-RAA方法使用病毒RNA即可直接進(jìn)行檢測，不需要反轉(zhuǎn)錄成cDNA。此外，反應(yīng)條件和特異性與其他RAA研究相似[2I-23]，表明RAA有望成為病原體檢測的通用技術(shù)。

4結(jié)論

建立的熒光RT-RAA法具有一定的準(zhǔn)確性、良好的特異性和較高的敏感性，其結(jié)果可通過熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時觀測。

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Establishment and application of a fluorescent assay for reverse transcription recombinase - mediated isothermal amplification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus

ZHANG Ziwei1，2，HUANG Chunyuan2，YU Na^1，3 ，ZHENG Jiaxin2， ZHANG Yan2，LIU Guangliang12，CAO Zongxi1，2，3.4

College of Animal Medicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830ooo， China; Key Laboratory of Tropical Animal Breeding and Epidemic Disease Research / Haikou Observation Experimental Station of National Data Center of Animal Health，Hainan Province/Institute of Animal Husbandryand Veterinary Medicine，Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 5711OO， China; 3. Tarim Animal Epidemic Disease Diagnostic and Prevention and Control Engineeing Laboratory of Xinjiang Production and Construction Corps， Faculty of Animal Science and Technology， Tarim University，Aral Xinjiang 8433Oo，China; Samya Research Institute， Hainan Academy of Agricultural Sciences （Hainan Research Centre of Laboratory Animal），Sanya Hainan 572000，China）

Abstract：【Objective】 There is a need for the development of a clinically rapid，simple，and accurate method for the detection of PRRSV.【Methods】 This study aims to establish a method based on reverse transcription recombinase -mediated isothermal amplification fluorescence detection of PRRSV. The method was developed by designing specific primers and probes against the PRRSV ORF4 gene sequence. 【Results】 The fluorescent RT-RAA assay could be amplified with primers and probes at 41% for 20min ，and the results could be observed in real time bya fluorescence quantitative PCR instrument. The method had high sensitivity and strong specificity，and no cross-reactivitywith other porcine pathogens.【Conclusion】The fluorescent RT- RAA and PCR used to test 18O samples showed the compliance rate between the two methods was 98.3% （20

Key Words：porcine reproductive and respiratory syndrome virus； ORF4； RAA;rapid detection