中圖分類號(hào)：S188 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-4330（2025）05-1266-07

0 引言

【研究意義】平菇（Pleurotus spp.）隸屬于擔(dān)子菌亞門Basidiomyceta、蘑菇目Agarieales、側(cè)耳科 Pleurotaceae、側(cè)耳屬 Pleurotus[1]，泛指生產(chǎn)栽培中的一類側(cè)耳屬食用菌[2.3]，又稱糙皮側(cè)耳物種復(fù)合群 Pleurotus ostreatus species complex[4.5]2021年我國平菇產(chǎn)量達(dá)611 ?34×10⁴t ，占我國食用菌總產(chǎn)量的 14.79% ，是我國第三大栽培菇種，平菇在我國新疆栽培范圍最廣、產(chǎn)量最高。野生平菇種質(zhì)資源具有遺傳背景廣、變異大、抗逆性強(qiáng)等特征，是選育優(yōu)良菌種的有利資源[4]，新疆野生平菇種質(zhì)資源豐富，然而目前關(guān)于新疆野生資源遺傳多樣性的情況并不明確。研究新疆野生平菇的遺傳多樣性，對(duì)開發(fā)挖掘平菇新品種基礎(chǔ)材料有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ITS（internaltranscripitingspacer，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）序列是真菌中應(yīng)用最廣泛的核糖體基因片段，被認(rèn)為是真菌的 DNA 條形碼[7-8]。 ISSR（inter－ simple se-quencerepeat）分子標(biāo)記多態(tài)性高、重復(fù)性好、成本低，是目前在食用菌中使用最廣泛的分子標(biāo)記之-[9-10]。ITS 和 ISSR分子標(biāo)記在側(cè)耳屬遺傳多樣性研究中均有廣泛應(yīng)用[4.8-17]，He等[8]對(duì)不同側(cè)耳屬菌株的ITS序列進(jìn)行了菌株內(nèi)、種內(nèi)及種間多態(tài)性分析，以評(píng)估ITS片段作為側(cè)耳屬DNA條形碼的可靠性，結(jié)果表明，除鮑魚菇外，ITS片段對(duì)其他側(cè)耳屬可進(jìn)行有效鑒定。努爾孜亞·亞力買買提等[\"]采用ISSR標(biāo)記對(duì)不同來源的野生平菇菌株進(jìn)行了遺傳多樣性分析，顯示出較強(qiáng)的地域性，其中2株新疆野生菌株分在2個(gè)類群中。【本研究切入點(diǎn)】目前有關(guān)新疆野生平菇生物學(xué)特征和遺傳多樣性方面的研究相對(duì)匱乏，需對(duì)從新疆不同區(qū)域采集的40個(gè)平菇菌株進(jìn)行菌絲培養(yǎng)和遺傳多樣性評(píng)價(jià)。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用生物學(xué)培養(yǎng)和ITS/ISSR分子標(biāo)記相結(jié)合的方法，確定菌株間的親緣關(guān)系和菌絲培養(yǎng)特點(diǎn)，篩選優(yōu)異種質(zhì)，為豐富和開發(fā)平菇可利用性種質(zhì)資源與育種材料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1. 1.1 供試菌株

40個(gè)供試菌株保藏于新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所食用菌菌種庫。

1. 1.2 培養(yǎng)基

PDA標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基：稱 46g （PDA），加蒸餾水定容 1000mL，121% ， 15min 高壓滅菌，用于菌絲純化和培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 菌株純化

在凈化工作臺(tái)上，對(duì)40個(gè)野生平菇菌株進(jìn)行菌株活化，將母種接種至PDA培養(yǎng)基平板，置于25^°C 培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。待菌絲長好后挑取菌落邊緣新生菌絲轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基平板，連續(xù)轉(zhuǎn)接兩次即可得到純化菌株。

1.2.2 菌絲培養(yǎng)和菌落特征測定

待純化菌絲長滿平板后，用直徑為 9mm 的打孔器在菌落邊緣處取大小相同菌塊，分別接種于PDA培養(yǎng)基平板中心，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，放置 25^°C 培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7d。每日監(jiān)測菌絲的生長狀況，并對(duì)菌絲顏色、菌落邊緣形態(tài)、菌絲長速、菌絲長勢(shì)等進(jìn)行定期統(tǒng)計(jì)。采用“十\"字形交叉法測定菌落直徑，計(jì)算菌絲生長速度。

1. 2.3 菌絲體培養(yǎng)和收集

將純化菌株用直徑 0.5cm 打孔器取菌塊接種至鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基平板上，置于 25°C 恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)5～7d，待菌絲長滿時(shí)，用滅菌的小藥匙沿著玻璃紙的表面將菌絲體輕輕刮下，收集至濾紙包好后放置烘干箱內(nèi) 35^°C 烘干備用。

1.2.4 DNA提取和ITS序列測定

采用試劑盒法（新型植物基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司）進(jìn)行基因組DNA的提取，用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量和PCR產(chǎn)物，Nano-5OO測定DNA的濃度，而后用滅菌的雙蒸水將樣品DNA濃度調(diào)至50ng/μL 左右，放至 -20% 冰箱內(nèi)保存待用。

采用通用引物 ITS1-F/ITS4^[18] 作為擴(kuò)增和測序引物，擴(kuò)增ITS序列。PCR反應(yīng)體系 25μL 引物（ 10μmol/L 各 1.0μL 模板 2.0μL，2×Taq PCRMasterMix 12.5μL 無菌雙蒸水補(bǔ)足至25μL 。PCR擴(kuò)增程序： 94^°C 預(yù)變性 4min 94^°C 變性45s， 55^°C 退火 延伸 1min，30 個(gè)循環(huán)，72% 修復(fù)延伸 10min 。

測序工作委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成，采用BioEdit軟件讀取自測序列，對(duì)于因poly結(jié)構(gòu)或基因組內(nèi)缺失突變導(dǎo)致的套峰，采用反向測序，并采用Sequenchervl.1.4軟件拼接得到理想序列。將修飾好的自測序列在NCBI上進(jìn)行BLASTn比對(duì)，選取挑選出相似度 99% 以上，覆蓋度 90% 以上的序列構(gòu)建數(shù)據(jù)集，用MEGA7.O中Neighbor-joining法（Maximum like-hoodBootstraptrials =1 000 ），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 ISSR擴(kuò)增與聚類

通過引物篩選試驗(yàn)[19]從28個(gè)引物中篩選出10個(gè)引物，進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和程序參考朱堅(jiān)[19]和李輝平[20]的方法。電泳結(jié)果進(jìn)行人工比對(duì)校正，有條帶記為1，無條帶記為0，構(gòu)建初始“0/1\"矩陣表。統(tǒng)計(jì)條帶總數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)并計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率 P ，計(jì)算公式為 P= k/n（100%） ，式中， P 為多態(tài)性條帶比率， k 為多態(tài)性條帶數(shù)， n 為測定的位點(diǎn)總數(shù)。表1

表1供試ISSR引物的序列

Tab.1 Sequence of ISSR primers usedinthestudy

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用NTSYSpcVersion2.1分析軟件根據(jù)SM相似系數(shù)按非加權(quán)組算數(shù)平均數(shù)（UPGMA）進(jìn)行遺傳相似性聚類，根據(jù)聚類圖分析供試野生平菇菌株間的遺傳多樣性及遺傳分化特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生平菇菌株菌絲培養(yǎng)特征比較

研究表明，40個(gè)野生平菇菌株菌絲顏色基本均為白色，菌絲較為濃密且邊緣整齊，菌落形態(tài)上無顯著差異。在菌絲生長速度方面差異較顯著，其中菌株XPG017和XPG021生長最快，平均生長速度為 11.85mm/d ；菌株XPG006生長最慢，平均生長速度為 5.75mm/d 。圖1，表2

2.2 ITS序列測定

研究表明，將40個(gè)平菇菌株大致劃分為4個(gè)類群，基本判定糙皮側(cè)耳（ P. ostreatus）有31個(gè)，佛羅里達(dá)側(cè)耳（P.floridanus）有6個(gè)，刺芹側(cè)耳（P.eryngii）有2個(gè)，肺形側(cè)耳（P.pulmonarius）有1個(gè)。圖2

表2平菇菌株的菌絲培養(yǎng)特征描述

Tab.2 The description of culture characteristics for Pleurotus spp.

續(xù)表2 平菇菌株的菌絲培養(yǎng)特征描述

Tab.2 The description of culture characteristics for Pleurotus spp

注：菌絲生長速度后的字母代表顯著性差異，小寫字母表示顯著水平 α=0.05 ，大寫字母表示 α=0 .01Notes：The lower case letter representsthe significant level α∝0.05 ，and the upper case letter represents the α∝0.01

圖1 平菇的菌絲形態(tài)特征 Fig. 1Hyphae of Pleurotus spp.

圖2 基于ITS序列的野生平菇的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.2 Phylogenetictreebased on ITS sequence

2.3 遺傳多態(tài)性

研究表明，10條引物對(duì)40個(gè)供試菌株進(jìn)行ISSR-PCR，不同引物擴(kuò)增出的條帶在6～11條，共擴(kuò)增出83條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出8.3條。對(duì)每個(gè)引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)和多態(tài)性條帶比例進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，平均多態(tài)性條帶比率為 98.80% ，除P₂ 外，其他9個(gè)引物擴(kuò)增的條帶多態(tài)性比率均為100.00% ，供試野生平菇菌株間的遺傳多態(tài)性較高。表3，圖3

在相似系數(shù)0.6時(shí)，40個(gè)菌株可劃分為3個(gè)類群：XPG001單獨(dú)為第I類群；XPG002和XPG006為第Ⅱ類群，其余為第Ⅲ類群，包含37個(gè)菌株，占總數(shù)的 92.50% ;在相似度為0.66時(shí)，又將第Ⅲ類群劃分為3個(gè)類群，其中采自察布查爾縣的XPG014單獨(dú)為一個(gè)類群；第二類群除了XPG028、XPG043、XPG047采自哈巴河縣，其余均采自烏魯木齊昌吉一帶;剩余第三類群采自伊犁哈薩克自治州、塔城地區(qū)與阿勒泰地區(qū)，顯示出較強(qiáng)的地域性，不同地理分布的新疆野生平菇具有較豐富的遺傳多樣性。圖4

表3 ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性 Tab.3 Primerspolymorphism montained byISSRanalysis

3討論

3.1邊銀丙2認(rèn)為其包括糙皮側(cè)耳 P ostrea-tus、紫孢側(cè)耳 P ：sapidus、白黃側(cè)耳 P . cornucopiae、肺形側(cè)耳P.pulmonarius和佛州側(cè)耳 P florida等5種可以人工栽培的食用菌，統(tǒng)稱為側(cè)耳類食用菌;鄭素月等[2]認(rèn)為除了以上5個(gè)種之外，還包含鳳尾菇P.sajorcaju;張瑞穎等[3研究表明，已知側(cè)耳屬有50種，商業(yè)化栽培的有10余種，且這些近緣種之間大多可以雜交；Li等[4.13]從生物進(jìn)化角度出發(fā)，結(jié)合形態(tài)特征指出我國的栽培“平菇”包含7個(gè)物種，即冷杉側(cè)耳P.abieticola、佛羅里達(dá)側(cè)耳P.floridanus刺芹側(cè)耳 P ：eryngii糙皮側(cè)耳P.ostreatus、卵孢側(cè)耳P.placentode肺形側(cè)耳 P. pulmonarius和白靈側(cè)耳 P ，tuoliensis，糙皮側(cè)耳復(fù)合群在側(cè)耳屬中是一個(gè)自然的單系，全球糙皮側(cè)耳復(fù)合群的系統(tǒng)發(fā)育分析可識(shí)別出20個(gè)系統(tǒng)發(fā)育種，劃分為3個(gè)支系及7個(gè)亞支系。因此對(duì)平菇種質(zhì)資源進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定和遺傳多樣性評(píng)價(jià)是開展優(yōu)良菌株選育和新品種開發(fā)，進(jìn)而促進(jìn)整個(gè)平菇產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的前提和基礎(chǔ)。

圖3 ISSR-PCR電泳圖譜（引物 P₁₁?P₁₈ 和 P₂₄ ）

Fig.3Agarose gel electrophoretic analysis of ISSR-PCR（ Primer P₁₁，P₁₈ and P₂₄ ）

圖4 供試平菇菌株ISSR多態(tài)性聚類

Fig.4The dendrogram based on ISSR of Pleurotus spp.

3.2采用生物學(xué)、ITS和ISSR 相結(jié)合的方法，欲從不同角度對(duì)新疆野生平菇菌株進(jìn)行多樣性評(píng)價(jià)，然而40個(gè)菌株的菌落形態(tài)無明顯差異。ITS作為非編碼區(qū)，承受的選擇壓力較少，相對(duì)進(jìn)化速率較快，并且能夠提供詳盡的系統(tǒng)學(xué)分析所需要的可遺傳性狀，被認(rèn)為是真菌分類的首選條形碼，能對(duì)平菇中大多物種進(jìn)行有效鑒定區(qū)分[8]。ISSR分子標(biāo)記因無需預(yù)先克隆和測序，簡便有效，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、遺傳作圖、基因定位及分析和評(píng)估生物種群的遺傳多樣性等方面[18]。研究中，ITS和ISSR均能明顯將 P ：pulmonarius ?_?P eryngii與其他菌株區(qū)分開來，ITS還能將 P. flori-danus鑒定出來，在物種鑒定方面比ISSR更為有效，然而ISSR標(biāo)記可以將菌株按地理分布進(jìn)行劃分。二者從不同角度證明了新疆野生平菇菌株具有豐富的遺傳多樣性。

4結(jié)論

采集于新疆境內(nèi)的40個(gè)平菇樣本經(jīng)ITS序列測定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，可大致劃分為4個(gè)類群；對(duì)其生物學(xué)菌絲培養(yǎng)特征包括菌絲長速、長勢(shì)、菌落形態(tài)進(jìn)行了描述；10條ISSR引物共擴(kuò)增出83條清晰的DNA條帶，多態(tài)性條帶82條，多態(tài)比率為 98.80% 。遺傳相似系數(shù)為0.66時(shí)，可將40個(gè)樣本分為5個(gè)類群，并顯示出較強(qiáng)的地域性。

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Identification and genetic diversity of wild Pleurotus in Xinjiang

LUO Ying1，2，Nurziya Yarmamat1*，JIA Wenjie'， ZHU Qi² ， LI Yutong2，SHI Wenting2，JIA Peisong'

（1. Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crop in Northwestern Oasis， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Institute of Plant Protection，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi ， China; 2. Xinjiang Agricultural University， Urumqi 83Oo91， China）

Abstract：【Objective】 The objective of the study is to analyze their genetic diversity of wild strains of the Pleurotus in Xinjiang in the hope of providing basic materials and theoretical basis for enriching and developing new varieties.【Methods】 The ITS sequence was used to identify the species and the ISSR markers technology to carry out the genetic diversity analysis on 4O wild oyster mushroom strains.【Results】The mycelia of 40 strains of wild oyster mushroom in Xinjiang were basically white，and there were no significant diferences in colony morphology，but certain diferences in mycelia growth and growth speed. By ITS sequence analysis，40 strains couldbe divided into 4 groups.10 ISSR primersamplified atotal of 83 clear DNA bands，including 82 polymorphic bands with a polymorphism ratio of 98.8O% ，and the 40 tested strains were divided into 5 groups at thegenetic similarity coeficient ofO.66.In general，the 4O strains of wild oyster mushroom tested showed significant genetic diversity，which had important reference value for the breeding of Xinjiang oyster mushroom.【Conclusion】Pleurotus spp. strains have the occurrence of genetic differentiation with relatively rich genetic diversity.

Key words： oyster mushroom； Pleurotus ostreatus species complex； ITS;ISSR ;genetic diversity