在人體眾多的必需微量元素中，銅在骨骼形成和組織發(fā)育等眾多基礎(chǔ)生理活動中都發(fā)揮著不可或缺的作用；同時，銅也是多種金屬酶的關(guān)鍵組分[1-3]。銅在電線制造、管道鋪設(shè)以及工業(yè)機(jī)械生產(chǎn)等諸多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，由此引發(fā)的環(huán)境污染問題備受關(guān)注[4]。過量的 Cu²⁺ 可誘發(fā)一系列嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病、威爾遜病及癌癥等[5-7]。因此，開發(fā)精準(zhǔn)且高效的檢測方法用于生物樣本及環(huán)境樣本中 Cu²⁺ 的檢測，在理論研究與實際應(yīng)用中均具有重要意義。

痕量 Cu²⁺ 的測定常采用原子吸收光譜法、電化學(xué)分析法以及電感耦合等離子體質(zhì)譜法等[8-10]。然而，這些方法存在儀器昂貴和樣品制備流程繁瑣復(fù)雜等問題。與上述傳統(tǒng)儀器測量方法相比，熒光探針法不僅具備高選擇性與高靈敏度，而且操作更簡便、檢測速度更快，能夠更高效地實現(xiàn)對痕量 Cu²⁺ 的檢測，因此備受關(guān)注。鑒于 Cu²⁺ 所具有的順磁特性，已報道的 Cu²⁺ 熒光探針多為熒光猝滅型探針[11-12]。然而，這類熒光猝滅型探針在實際應(yīng)用中極易受到客觀環(huán)境以及多種其它因素的影響，可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確[13-14]。Zhou等[15]報道了一種 Cu²⁺ 猝滅型探針，能夠在體外對 Cu²⁺ 進(jìn)行靈敏檢測，具有很低的檢出限；但是，在活細(xì)胞實驗中，由于溶酶體的酸性環(huán)境導(dǎo)致探針自發(fā)猝滅，產(chǎn)生高達(dá) 32% 的假陽性信號。與此相比， Cu²⁺ 增強(qiáng)型熒光探針因具有背景信號低和信噪比高的特性，在檢測準(zhǔn)確性和生物應(yīng)用方面顯著優(yōu)于猝滅型探針。例如， Yan 等[16]對比了多種 Cu²⁺ 探針的性能，指出基于熒光增強(qiáng)機(jī)制的探針（如比率型或熒光恢復(fù)型）通過多信號校正顯著降低了背景干擾，并且在活細(xì)胞成像中的背景信號僅為猝滅型探針的1/5。這些研究顯示了增強(qiáng)型探針通過\"信號激活\"機(jī)制在復(fù)雜環(huán)境中實現(xiàn)可靠檢測的優(yōu)勢。但是，Cu²⁺ 的順磁特性使增強(qiáng)型熒光探針的開發(fā)面臨很大挑戰(zhàn)。

本研究以芘基團(tuán)為熒光生色團(tuán)，利用其易產(chǎn)生激基締合物的特征消解 Cu²⁺ 的順磁性導(dǎo)致的熒光猝滅。將芘生色團(tuán)與吲哚-3-甲酰肼化合產(chǎn)生席夫堿化合物，以生成的碳氮雙鍵以及甲酰肼基團(tuán)鍵合 Cu²⁺ 席夫堿化合物具有的碳氮雙鍵與甲酰肼部分的羰基協(xié)同構(gòu)筑了一個富電子的空間微環(huán)境，該微環(huán)境因具備特定的電子云密度與空間取向，可以為 Cu²⁺ 的結(jié)合提供識別位點。將合成的PIN分子用作 Cu²⁺ 增強(qiáng)型熒光探針，能夠在溶液中高選擇性、高靈敏地識別 Cu²⁺ ，而 Cu²⁺ 起的PIN分子的聚集還使得PIN能夠?qū)?Cu²⁺ 呈現(xiàn)比色探針性能。將PIN制備成 Cu²⁺ 熒光檢測試紙，能夠方便、快捷地檢測溶液中的 Cu²⁺ 。將PIN探針用于環(huán)境水中游離 Cu²⁺ 的檢測，顯示出良好的應(yīng)用潛力。

1 實驗部分

1. 1 儀器與試劑

NMR Systems 600MHz 波譜儀（美國Varian公司）；solanX70FT-MS高分辨質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）；FL-4600 型熒光分光光度計（日本日立公司）；UV-2700型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；ZetasizerNano ZS90動態(tài)光散射儀（DLS，英國馬爾文儀器公司）。

吲哚-3-甲酰肼和芘甲醛（百靈威科技有限公司）；無水乙醇、N，N\"-二甲基甲酰胺（DMF）和乙腈（天津大茂化學(xué)試劑廠）。所用試劑均為分析純；實驗用水均為去離子水。在氘代二甲基亞砜（DMSO- ?d₆ 中使用四甲基硅烷（TMS）作內(nèi)標(biāo)；金屬離子選用其氯化物或硝酸鹽。

1.2 實驗方法

1.2.1PIN的合成與表征

準(zhǔn)確稱取 0.1207g 吲哚-3-甲酰膚（ ：0.7mmol 和 0.1122g 芘甲醛 （0.5mmol ，加入 25.0mL 乙醇充分溶解后加熱攪拌回流。反應(yīng)過程中不斷產(chǎn)生黃色沉淀，約 ^4h 后反應(yīng)結(jié)束。PIN的合成路線見圖1。反應(yīng)后的溶液經(jīng)真空抽濾后，加無水乙醇反復(fù)洗滌黃色沉淀，再經(jīng)真空干燥后獲得目標(biāo)產(chǎn)物，產(chǎn)量 0.1167g ，反應(yīng)產(chǎn)率為 60.0% 。產(chǎn)物的 ¹H NMR（ 600MHz ，DMSO- ?d₆，δ ）分別為：11.83（s，1H），11.63（s，1H），9.40（s，1H），8.85（s，1H），8.60（d， J=8.1 ，1H），8.38（m，5H），8.26（dd， J=19.1 ，8.9，3H）， 8.14（t，J=7.6， 1H），7.53（d， J=7.9 ，1H）， 7.22（m，2H） 。 ¹C NMR（ 125MHz ， DMSO-d₆，δ^? 分別為：136.6，132.0，131.4，130.7，129.0，128.1，127.9，126.5，125.8，125.2，124.7，124.3，123.0，122.8，121.7，121.3，112.5。產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜測試結(jié)果：m/z388.1451，理論計算相對分子質(zhì)量 PIN+H⁺ 為388.1450。

1.2.2PIN溶液的配制及其光譜測量

以DMF為溶劑配制 5.0mmol/L PIN儲備溶液，再將其用乙腈-水（70：30，V/V）配制成探針溶液。分別取 Cu²⁺ 、 Al³⁺ 1 Ca²⁺ 和 Cd²⁺ 等16種常見金屬離子的氯化物或硝酸鹽，配制成 5.0mmol/L 溶液。光譜測量均在室溫下進(jìn)行，熒光激發(fā)波長為 365nm ，選擇 495nm 處的熒光發(fā)射強(qiáng)度為熒光響應(yīng)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針PIN對 Cu²⁺ 的比色響應(yīng)

首先測試了PIN分子的紫外-可見（UV-vis）吸收光譜，以及其在16種常見金屬離子（ Ag⁺ 、 K_，N⁺ Mg²⁺ ！

Ba²⁺ 、 Ca²⁺ 、 Cd²⁺ 、 Co²⁺ 二、 Cu²⁺ 、 Mn²⁺ 、 Pb²⁺ 、 Ni²⁺ 、 Hg²⁺ 、 Zn²⁺ 、 Al³⁺ 、 Cr³⁺ 和 Fe³⁺ ）存在時的UV-vis光譜。如圖2A所示，單獨PIN溶液在 370nm 附近具有強(qiáng)的紫外吸收譜帶，這歸屬為芘基團(tuán)的特征吸收峰[17]。在PIN溶液中分別加入16種常見的金屬離子后，只有加入 Cu²⁺ 能夠使PIN的UV-vis光譜發(fā)生更加明顯的變化，在 440nm 附近出現(xiàn)一個新的吸收峰，而加入其它15種常見金屬離子僅引起PIN紫外吸收峰強(qiáng)度的微弱變化。同時，當(dāng)向PIN溶液中不斷滴加 Cu²⁺ 時，UV-vis光譜滴定實驗結(jié)果如圖2B所示，PIN溶液在 440nm 附近出現(xiàn)新的吸收峰且呈現(xiàn)明顯的增色效應(yīng)。此峰應(yīng)是加入 Cu²⁺ 引起了探針分子聚集[18-19]，從而使其上的芘基團(tuán)也發(fā)生聚集，這一特征峰歸屬于芘基團(tuán)聚集體。此外，如圖2B及插圖所示，PIN溶液在 440nm 處產(chǎn)生新的吸收峰，此時溶液顏色由無色變?yōu)辄S色，PIN對 Cu²⁺ 表現(xiàn)出比色的識別性能。以上實驗結(jié)果顯示，可以基于PIN的UV-vis吸收光譜的變化和溶液顏色變化識別和檢測 Cu²⁺ ，PIN是一種高選擇性 Cu²⁺ 比色探針。

2.2 PIN分子對 Cu²⁺ 的熒光識別

考察了PIN分子的熒光發(fā)射性能以及其對不同金屬離子的熒光識別能力。將16種常見金屬離子分別滴加到PIN溶液中，觀察溶液熒光顏色的變化并測試其熒光發(fā)射光譜變化。如圖3A所示，PIN溶液在 365nm 紫外燈照射下呈現(xiàn)淡藍(lán)色熒光；分別滴加 20.0μmol/L 多種金屬離子后，只有加入 Cu²⁺ 使PIN溶液呈現(xiàn)出強(qiáng)的綠色熒光，其它常見金屬離子幾乎不影響PIN溶液的熒光顏色。如圖3B所示，單獨PIN溶液的熒光發(fā)射光譜在 438nm 附近呈現(xiàn)一個弱而寬的熒光發(fā)射峰，這是芘生色團(tuán)單體的特征熒光發(fā)射峰[19-20]。向PIN溶液中分別加入16種常見的金屬離子后，只有加入 Cu²⁺ 能夠引起PIN熒光光譜發(fā)生顯著變化，這與UV-vis吸收光譜呈現(xiàn)的結(jié)果一致。雖然加入 Al³⁺ 、 Cr³⁺ 和 Fe³⁺ 能夠引起PIN熒光發(fā)射峰微弱增強(qiáng)，表明這3種離子與PIN分子結(jié)合，但與加入 Cu²⁺ 引起的變化完全不同。以上這些實驗結(jié)果充分說明PIN分子是一種高選擇性的 Cu²⁺ 增強(qiáng)型熒光探針。如圖3C所示，在 Cu²⁺ 滴定實驗中，隨著Cu²⁺ 逐漸加入，PIN溶液在 495nm 附近出現(xiàn)一個新的更寬更強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，半峰寬達(dá)到 112nm ，且紅移 65nm ，其發(fā)射峰強(qiáng)度增強(qiáng)約 20倍，這種發(fā)射峰通常為熒光發(fā)色團(tuán)的聚集峰[19.21]。以上熒光光譜實驗結(jié)果與UV-vis吸收光譜結(jié)果一致，表明 Cu²⁺ 能夠與PIN分子發(fā)生強(qiáng)相互作用，使其產(chǎn)生明顯聚集，這也是加入 Cu²⁺ 后PIN溶液熒光顏色發(fā)生明顯變化的原因。加入 Cu²⁺ 的PIN溶液的動態(tài)光散射測試結(jié)果如圖4A所示，混合溶液中存在納米級粒子，進(jìn)一步證明 Cu²⁺ 能使PIN分子產(chǎn)生聚集。此外，測量了加入Cu²⁺ 前后的PIN溶液的熒光壽命，結(jié)果表明，單獨PIN溶液的熒光壽命為 4.2ns ，而加入 Cu²⁺ 后PIN溶液的熒光壽命為 17.7ns ○

基于圖3C所示的PIN溶液熒光發(fā)射峰強(qiáng)度隨加入 Cu²⁺ 濃度變化的結(jié)果，參照文獻(xiàn)[21]，利用Leven-berg-Marquardtalgorithm方程進(jìn)行曲線擬合。如圖4B所示，先求得不同 Cu²⁺ 濃度下的 （I-I₀）/（I_max-I₀） 值，其中，I為PIN溶液的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度， I₀ 為單獨PIN溶液的最大熒光發(fā)射峰強(qiáng)度， I_max 為 Cu²⁺ 存在時PIN溶液最大熒光發(fā)射峰強(qiáng)度；然后，通過該方程擬合獲得結(jié)合常數(shù)為 3.42×10¹²L²/mol² ，相關(guān)系數(shù) R² 為

0.996，顯示出PIN探針與 Cu²⁺ 的結(jié)合力較強(qiáng)，且PIN 與 Cu²⁺ 之間的化學(xué)計量比是2：1。

2.3PIN熒光探針識別 Cu²⁺ 的靈敏度、穩(wěn)定性及抗干擾性

采用熒光探針PIN檢測不同濃度的 Cu²⁺ ，如圖5A所示，隨著 Cu²⁺ 濃度增加，PIN在 495nm 處的熒光強(qiáng)度逐漸增加，在 0.1～15.0μmol/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為 y=14.1x+19.8 R²=0.994 ， Cu²⁺ 檢出限（ LOD=3S/k s 為空白PIN溶液在 495nm 處的熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差（ n=10 ）， k 為擬合曲線的斜率[19，22]）為 78.7nmol/L 。PIN探針對 Cu²⁺ 的檢出限遠(yuǎn)低于我國國家標(biāo)準(zhǔn)[23]關(guān)于生活飲用水中 Cu²⁺ 的限量標(biāo)準(zhǔn)（ 1.0mg/L ， 15.7μmol/L ）。與文獻(xiàn)報道的其它 Cu²⁺ 檢測方法相比（表1），PIN探針具有較低的檢出限，表明PIN是一種高靈敏的 Cu²⁺ 熒光探針。

為了考察PIN熒光識別 Cu²⁺ 的穩(wěn)定性，測量了PIN溶液在 438nm 處以及加入 20.0μmol/LCu²⁺ 后在495nm 處熒光發(fā)射峰強(qiáng)度隨時間的變化情況，結(jié)果如圖5B所示。PIN分子呈現(xiàn)穩(wěn)定的熒光發(fā)射性能，加人 Cu²⁺ 后能夠快速熒光響應(yīng)，在 7min 達(dá)到穩(wěn)定。PIN分子在不同 pH 條件下對 Cu²⁺ 的熒光識別如圖5C所示，可見PIN分子能夠在較寬的 pH 范圍內(nèi)（ pH3～9， 熒光識別 Cu²⁺ 。

對PIN探針的抗離子干擾能力進(jìn)行了考察。先將 20.0μmol/L 的 Cu²⁺ 分別與 20.0μmol/L 其它不同的常見金屬離子混合，再測量此混合離子加入前后PIN溶液熒光光譜的變化。如圖5D所示， Al³⁺ 、 Cr³⁺ 和 Fe³⁺ 會對PIN探針熒光識別 Cu²⁺ 產(chǎn)生干擾，這是由于這3種離子也能夠與PIN分子發(fā)生較強(qiáng)的結(jié)合，從而對 Cu²⁺ 的熒光識別產(chǎn)生干擾。因此，除個別三價金屬離子外，PIN探針在熒光識別 Cu²⁺ 時表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗干擾能力。

2.4PIN探針對 Cu²⁺ 的識別機(jī)理

利用密度泛函理論（DFT）對PIN- ?Cu²⁺ 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化和計算[32]。如圖6A所示，在最優(yōu)結(jié)構(gòu)的PIN- ?Cu²⁺ 復(fù)合物中， Cu²⁺ 與兩個探針分子上的羰基氧原子和席夫堿基團(tuán)上的氮原子發(fā)生結(jié)合，4個配位鍵的鍵長分別為2.0318、2.0436、2.0891和2.0983A，顯示 Cu²⁺ 與探針分子之間的強(qiáng)相互作用。同時，在最優(yōu)結(jié)構(gòu)中還觀測到芘生色團(tuán)聚集，這與前文中紫外-可見吸收光譜與熒光發(fā)射光譜呈現(xiàn)的結(jié)果一致，均表明PIN能夠識別 Cu²⁺ 是由于 Cu²⁺ 的結(jié)合能引起芘生色團(tuán)聚集。PIN分子和PIN- ?Gu²⁺ 復(fù)合物的分子軌道能級及其最可能的電子轉(zhuǎn)變途徑計算結(jié)果如圖6B所示，與單獨PIN分子的LUMO與HOMO能級相比，PIN- Cu²⁺ 復(fù)合物的HOMO與LUMO明顯降低。同時，HOMO與LUMO的能級差在 Cu²⁺ 結(jié)合前為3.275eV ，在 Cu²⁺ 結(jié)合后降至 2.287eV 。利用 ¹H NMR波譜研究了PIN與 Cu²⁺ 的結(jié)合模式。由于 Cu²⁺ 具有順磁性， ¹HNMR 波譜僅測試了少量 Cu²⁺ 存在時PIN的質(zhì)子峰變化。如圖6C所示，當(dāng)PIN溶液中加入Cu²⁺ 后，氫質(zhì)子b的核磁信號峰消失以及質(zhì)子c和 d 的核磁信號峰向低場移動，均顯示PIN分子中的炭基氧原子以及席夫堿氮原子與 Cu²⁺ 進(jìn)行配位。因此，當(dāng) Cu²⁺ 加入到PIN溶液中，兩個PIN分子中羰基氧原子以及席夫堿氮原子均能與 Cu²⁺ 配位，使這兩個探針分子相互靠近；其上的芘基團(tuán)同時靠近并由于 π-π 以及疏水-疏水相互作用形成聚集體，在光譜上表現(xiàn)出從芘單體發(fā)射峰到聚集體特征峰的識別響應(yīng)。

2.5 實際樣品分析

為了進(jìn)一步研究熒光PIN在實際環(huán)境水樣中識別檢測 Cu²⁺ 的性能，選擇珠江水（廣州段）作為實際環(huán)境水樣，以其為溶劑配制PIN測試溶液，向其中滴加不同濃度的 Cu²⁺ ，檢測其熒光發(fā)射光譜的變化。如圖7A所示，當(dāng) Cu²⁺ 滴加到PIN珠江水測試溶液時，PIN呈現(xiàn)與圖3C中去離子水溶液中類似的熒光響應(yīng)，在 495nm 處出現(xiàn)新的顯著變寬的熒光發(fā)射峰，熒光發(fā)射峰強(qiáng)度相較初始熒光增強(qiáng)了10倍，并紅移52nm 。圖7B為 Cu²⁺ 濃度與PIN珠江水測試溶液在 495nm 處熒光強(qiáng)度的校正曲線，結(jié)果表明，在實際環(huán)境水樣中，PIN能夠?qū)τ坞x的 Cu²⁺ 表現(xiàn)出高靈敏的熒光識別能力，顯示PIN探針具有良好的應(yīng)用潛能。

通過將PIN分子附著到濾紙條上制作簡易熒光檢測試紙，實現(xiàn)簡便和快捷地利用PIN檢測 Cu²⁺ 。將市售定性濾紙剪成 2cm×3cm 大小的濾紙條，隨后將其浸入到 1.0mmol/L PIN溶液（溶劑為DMF，濃度為）中約 10min ，取出，真空干燥，備用[33-34]。取簡易熒光檢測試紙條浸沒在 15.7μmol/LCu²⁺ 溶液中，充分浸潤約 10min 后取出，采用 365nm 紫外光照射并記錄試紙的熒光顏色。如圖7B插圖所示，PIN簡易熒光檢測試紙條在 Cu²⁺ 溶液浸泡前后呈現(xiàn)非常明顯的熒光顏色差異，說明采用PIN熒光試紙能夠簡便、快捷地?zé)晒鈾z測 Cu²⁺ 。我國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[23]對飲用水中 Cu²⁺ 限量標(biāo)準(zhǔn)為 1.0mg/L （約為15.7μmol/L ，采用制備的試紙條能夠非常清晰地觀測到 |起的熒光顏色變化，顯示合成的PIN探針可望制備成試紙條用于實際水樣中 Cu²⁺ 的簡便、快速分析。

3 結(jié)論

使用吲哚-3-甲酰肼對芘基團(tuán)進(jìn)行修飾，合成了一種 Cu²⁺ 增強(qiáng)型熒光探針PIN。PIN能夠在溶液中通過比色和熒光兩種模式高選擇性識別 Cu²⁺ ，具有靈敏度高、光穩(wěn)定性好、適用 pH 范圍寬和抗離子干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點。結(jié)合熒光滴定實驗、動態(tài)光散射、 ¹HNMR 以及DFT等方法研究了PIN識別 Cu²⁺ 的機(jī)理。結(jié)果表明， Cu²⁺ 能夠引起PIN分子聚集，產(chǎn)生芘生色團(tuán)聚集特征識別信號，且二者之間結(jié)合作用力強(qiáng)，結(jié)合常數(shù)為 3.42×10¹²L²/mol² 。PIN探針可用于實際環(huán)境水樣中 Cu²⁺ 的檢測，還可以制作成熒光試紙，用于簡便、快捷地檢測溶液中的 Cu²⁺ 。本研究結(jié)果表明，PIN探針是一種性能優(yōu)異并具有良好實際應(yīng)用潛能的 Cu²⁺ 熒光探針。

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Synthesis and Applications of Indole-3-formylhydrazine Modified Pyrene Schiff Base Compound as Copper Ion Fluorescence Probe

WANG Mu-Xil，HUANG Zhen-Yu1， LIN Xiao-Feng1， LEI Xiao-Lan1，SUN Jian ^*2 ，MA Li-Jun*1 1（School of Chemistry， South China Normal University， Guangzhou 51OoO6， China） 2（Xinjiang Key Laboratory of Biopharmaceuticals and Medical Devices， Colege of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830017， China）

AbstractIn this work，a fluorescent probe PIN was synthesized using indole-3-carbohydrazide and pyrenecarboxaldehyde as raw materials. PIN showed weak fluorescence emission in aqueous solution with acetonitrile volume fraction of 70% . However， when Cu²⁺ was added to this aqueous solution of PIN，a new fluorescence emission peak appeared at 495nm ，and the intensity of this peak gradually increased with the increase of concentration of Cu²⁺ ，and also caused a significant change in the fluorescence color of the solution. In contrast，the additionof 15 kinds of other common metal ions did not cause such change.The detection limit of PIN for Cu²⁺ was 78.7nmol/L ， which was much lower than the maximum permitting level of Cu²⁺ in drinking water in hygienicstandard for drinking water in China.Therefore，PIN was a highly selective and sensitive fluorescenceenhanced probe for Cu²⁺ .Meanwhile，the addition of Cu²⁺ could also cause a new absorption peak at 440 nm in the ultraviolet-visible absorption spectrum of the aqueous solution of PIN，and meanwhile the colorless PIN solution changed into yellow，exhibiting the performance of PIN as a colorimetric probe for Cu²⁺ .By fitting with the Levenberg-Marquardt algorithm equation， the binding ratio of PIN to Cu²⁺ was 2： 1，and the binding constant was （2號 3.42×10¹²L²/mol² . In addition，the binding mode of PIN with Cu²⁺ was explored by using proton nuclear magnetic resonance （'H NMR） titration experiments and density functional theory simulations.The results showed that the addition of Cu²⁺ could cause the aggregation of PIN molecules to form excimers， thus showing highly selective recognition.Finally，PIN was made into a simple test strip，which could achieve rapid and convenient fluorescence detection of Cu²⁺ in actual water samples.