興奮劑問題是現(xiàn)代重大體育賽事組織過程中必須重點關注的問題，同時也是國際社會廣泛關注的焦點。為了保證公平競賽，世界反興奮劑機構（World Anti-Doping Agency，WADA）對于濫用違禁藥品的行為一直保持高壓態(tài)勢，制訂了嚴格的禁用物質清單[1]和檢測方法[2]。

從人體自身能否產(chǎn)生的角度，禁用物質可以分為外源性物質和內源性物質。外源性物質是指人體自身不能產(chǎn)生、須由外部引入的物質，如刺激劑、麻醉劑、合成蛋白同化制劑、利尿劑和 β₂ 阻斷劑等;內源性物質是指人體自身能夠產(chǎn)生的物質，主要包括肽類激素和甾體類固醇激素。從檢測角度考慮，外源性物質是體內原來沒有的，一旦查出即可判定為陽性；內源性物質需要區(qū)分是自身產(chǎn)生還是外部引入，只有外部引入才構成陽性。然而，外源性和內源性禁用物質在結構上并無差別，因此內源性物質檢測難度更大。

睪酮和去氫表雄酮是重要的類固醇激素，人體可以自身生成，具有調節(jié)動物生理功能的作用。一些不法商販可能會違規(guī)使用外源性的睪酮和去氫表雄酮以促進動物生長和提高肉質[3-4]，導致其在動物食品中殘留。因此，為防止誤食和誤判，保障運動員的聲譽，需建立可靠的檢測方法和鑒別方法，準確測定和鑒別食品中睪酮和去氫表雄酮的來源，保障賽事的食品安全。

氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素質譜法（Gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry，GC-C-IRMS）是目前公認的檢測內源性和外源性物質的有效手段[5]，WADA已將該技術形成技術文件[6]，供各國反興奮劑檢測組織使用。該技術基于自然界中碳同位素的分餾原理，通過分析樣品中 δ¹³C 值（即¹³CI¹²C 比值相對于V-PDB 國際標準的相對值）進行溯源。自然界中碳具有 ¹²C 和 ¹³C 兩種穩(wěn)定同位素，在光合作用、沉積作用、蒸騰作用等物理以及化學和生物過程中，輕質量的 ¹²C 和重質量的 ¹³C 進入不同相態(tài)的能力存在差異，終產(chǎn)物中的 ¹³CI¹²C 比值將產(chǎn)生差異。因此，來源于不同地域、種類、海拔、緯度、氣候和溫度的樣品，其 ¹³CI¹²C 比值不同。動物源性食品的 ¹³CI¹²C 比值取決于動物攝人營養(yǎng)物質中的碳同位素。根據(jù)此原理，可以利用GC-C-IRMS測定目標化合物的 δ¹³C 值，從而判斷其來源。該方法被廣泛用于檢測運動員尿樣和血樣等生物樣品。目前，研究人員已采用GC-C-IRMS方法成功測定了人尿中雄烯二酮代謝物[7]、去氫表雄酮[8-9]、內源性類固醇激素[10-13]、睪酮[14]、1-雄烯甾體 16α 羥基雄烯二酮/雄甾三烯二酮[15]、11-酮睪酮和11-酮二氫睪酮[16]、血中睪酮[17-18]、牛尿中氫化可的松[4]、睪酮和勃地酮制劑[19]、17β. -睪酮和 17β -雌二醇-3-苯甲酸酯[20]。以上報道均從反興奮劑檢測角度出發(fā)，針對運動員體液進行檢測，而針對動物源性食品中違禁藥物內源性和外源性鑒別的研究報道較少。趙超敏等[21建立了牛肉中孕酮的GC-C-IRMS檢測方法。牛肉樣品經(jīng)乙腈振蕩和超聲輔助提取、NaCI脫水、有機相離心和旋轉蒸發(fā)后，采用 ZnCl₂ 脫脂，然后用反相 LC-C₁₈ SPE柱、正相LC-Si硅膠柱和弱陰離子交換 LC-NH₂ 氨基色譜柱等固相萃取柱凈化，最后使用半制備液相色譜 C₁₈ 柱純化過濾液，采用GC-C-IRMS系統(tǒng)分析提取物。在此基礎上，趙超敏等[22]建立了黃油中雌酮、α/β雌二醇、雌三醇和孕酮等類固醇激素的GC-C-IRMS 檢測方法，樣品經(jīng)乙酸乙酯-環(huán)已烷（1：1，V/V）混合液提取、凝膠滲透色譜凈化和半制備液相色譜純化后，采用GC-C-IRMS系統(tǒng)進行分析。

對供賽食品或運動員體液進行睪酮和去氫表雄酮等興奮劑檢測，并準確判別其外源性或內源性來源，對于保證公平競賽、保障運動員的合法權益和維護運動員的職業(yè)聲譽至關重要。WADA[和一些科研人員[8.21]提出了一些鑒別方法用于興奮劑檢測，并進行了實際驗證，但相對而言，內外源鑒別研究尚需加大研究力度，開發(fā)更可靠、更準確的鑒別手段，降低誤判的概率。WADA[6規(guī)定通過計算內源性參考化合物 δ¹³C 值和目標化合物 δ¹³C 值的差值 Δδ¹³C 進行判別。判別規(guī)則如下： 和 Δδ¹³C_-5α 已二醇或 Δδ¹³C_-5β 已二醇）同時大于 3‰ ; 二醇和 Δδ¹³C_-5β 已二醇同時大于 3‰ ；（3）表睪酮濃度大于50ng/mL （女性）或大于 200ng/mL （男性），且 Δδ¹³C. 表睪酮大于 4‰ （4）Δδ¹³C_-#EAA 大于 3‰ 或 Δδ¹³C 本膽烷醇酮大于 4‰ ; （5）Δδ¹³C 雄酮在 2‰ 之間或 Δd¹³C. 本膽烷醇酮在 3‰ 之間，且 Δδ¹³C_-5αQ=βμ 或 Δδ¹³C -5β己二醇大于3‰ ; （6）Δδ¹³C_?5α⊥ 二醇大于 4‰ ，且 δ¹³C_-5α≡-???27% ： （7）Δδ¹³C. 福美斯坦或 Δδ¹³C 勃地酮或 Δδ¹³C 勃地酮代謝物大于4‰ 。若符合上述條件，則可判定樣品為陽性。趙超敏等[21]采用單因素方差分析方法，發(fā)現(xiàn)內源性孕酮和外源性孕酮的 δ¹³C 值存在顯著性差異。王靜竹等[8，13]以孕三醇為參照，測定去氫表雄酮、雄酮、本膽烷醇酮和 5β. -雄烷 ?3α，17β 二醇的 δ¹³C 值，結果表明，如上述4種化合物與孕三醇的 δ¹³C 值之比大于1.15，則可能有外源性類固醇引入。

相對而言，GC-C-IRMS分析技術比較完善，并已經(jīng)形成了部分行業(yè)標準方法[23]，但作為具有廣闊市場前景和應用前景的檢測技術，較短的分析周期和較高的分析效率、低廉的檢測成本是未來的發(fā)展趨勢，而鑒別方法研究相對比較薄弱，應開發(fā)更多新方法新技術，提高鑒別成功率、降低鑒別技術門檻。

為建立內源性和外源性物質新的檢測方法和鑒別方法，本研究開發(fā)了高效、經(jīng)濟的基于索氏提取的樣品前處理方法和基于GC-C-IRMS的睪酮和去氫表雄酮 δ¹³C 值分析方法，并在測量結果不確定度評估方法基礎上，建立了基于數(shù)據(jù)比對的牛肉中內源性和外源性睪酮和去氫表雄酮鑒別方法。本研究能夠有效區(qū)分牛肉中天然來源和外源性添加的辜酮和去氫表雄酮，為食品安全和質量監(jiān)管提供了重要的技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MAT253穩(wěn)定同位素比值質譜儀（美國ThermoFisherScientific公司），配備7890A氣相色譜儀、GC-IsoLink系統(tǒng)和Flash 2000型元素分析儀；ME614S電子天平（德國Sartorius公司）；MX-S渦旋混合器（美國Scilogex公司）；Transsonic Digitals超聲波清洗器（德國Elma 公司）；N-EVAPTM111氮吹儀（美國Organization Associates公司）；CR21GⅢ高速離心機（日本Hitachi公司）；RV10旋轉蒸發(fā)器（德國IKA公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。AgilentDB-5MS色譜柱（ 60m×0.32mm ， 0.25μm 和AgilentHP-5MS色譜柱（ 30m×0.25mm ， 0.25μm ）購自美國Agilent公司；聚苯乙烯-二乙烯基苯HLB固相萃取柱（ 6mL ， 500mg 購自美國Waters公司。

10種辜酮標準品，純度 gt;99.00% ，分別來自上海安譜實驗科技股份有限公司、曼哈格（上海）生物科技有限公司、中國食品藥品檢定研究院、上海義準生物有限公司、英國LGC公司、成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司、天津一方科技有限公司、上海甄準生物科技有限公司、上海詩丹德生物技術有限公司和壇墨質檢科技股份有限公司；14種去氫表雄酮標準品，純度 599.00% ，分別為來自上海吉至生化科技有限公司、美國Adooq Bioscience公司、上海安譜實驗科技股份有限公司、曼哈格（上海）生物科技有限公司、廣州佳途科技股份有限公司、美國ChromaDex公司、中國凱庫勒公司、英國LGC公司、成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司、美國MCE公司、天津一方科技有限公司、上海甄準生物科技有限公司、上海詩丹德生物技術有限公司和壇墨質檢科技股份有限公司。

IAEA600咖啡因中碳同位素標準物質（國際原子能機構， δ¹³C=-27.771%δ0±0.086% ， k=2 ）；NIST8540聚乙烯膜中碳同位素標準物質、NIST8542蔗糖中碳同位素標準物質和NIST8573 L -谷氨酸中碳同位素標準物質（美國國家標準與技術研究院， δ¹³C 值分別為 -32.15%0±0.10% 、 -10.45%0±0.07% 和-26.39%0±0.09% ， k=2 ）。

甲醇和乙腈（HPLC級，德國Merck公司）；氮氣、氮氣、氧氣和二氧化碳 （99.999% ，錦州科華能源有限公司）； β. -葡萄糖醛酸酶（山東科源生化有限公司）；乙酸、乙酸鈉和氯化鈉（優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司）。牛肉樣品均購于北京農(nóng)貿市場；干燥的牛肉粉末為中國計量科學研究院制備的標準物質原料。

1.2 實驗方法

1. 2. 1 樣品前處理

準確稱取 5g 粉碎的牛肉或者 3.5g 干燥的牛肉粉末樣品，置于 50mL 離心管中，加入 10mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液（ 0.2mol/L ， pH=5.2 ），振蕩搖勻 30s ；加入 300μLβ -葡萄糖醛酸酶，混勻，置于 37°C 恒溫搖床搖振過夜；冷卻至室溫后，加入乙腈，振蕩提取 20min ，再加人 5gNaCl ，振蕩混勻，于 4‰ 下6000r/min 離心 10min ，收集上清液備用，殘渣用乙腈再次提取；合并上清液，轉入旋轉蒸發(fā)瓶，于 70% 旋轉蒸發(fā)至近干，然后用 2×1mL 甲醇清洗蒸發(fā)瓶，轉移至 50mL 離心管中待凈化。將HLB固相萃取柱依次用 5mL 甲醇和 5mL 純水活化，然后將上述萃取液加入活化后的小柱，用 5mL 甲醇-水（1：9，V/V）淋洗，再用 10mL 甲醇進行洗脫，收集洗脫液至 15mL 離心管中，氮吹至近干。用 1mL 甲醇復溶，渦旋充分溶解，過 0.22μm 有機濾膜后，待測。

1. 2. 2 標準品的 δ¹³C 值分析

采用元素分析-穩(wěn)定同位素質譜法（Elemental analyzer-isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS）分析睪酮和去氫表雄酮等標準品的 δ¹³C 值。將約 100μg 標準品轉入錫囊中，編號并依次放入元素分析儀自動進樣器中，標準品在 960‰ 的富氧反應管中瞬間燃燒，產(chǎn)生的二氧化碳氣體在氮氣攜帶下進入填充色譜柱分離，再進人穩(wěn)定同位素比值質譜儀（IRMS）進行碳同位素分析。

EA條件C/N燃燒管溫度為 960^°C ，柱箱溫度為 50^qC ，達到預定溫度后穩(wěn)定 6h 以上開始測試；載氣為氦氣，流速為 200mL/min ；氧化氣為氧氣，流速為 200mL/min ，注氧時間為 3s ；標準氣為二氧化碳，流速為 100mL/min 。

質譜條件EI電離源；采用3個法拉第杯同時測定 m/z44 、45和46離子信號；質譜儀質量歧視效應采用NIST8540、NIST8542和NIST8573碳同位素標準物質線性校正。同位素測定結果以 δ¹³C 表示： δ¹³C=（R_?m/R_m?m-1）×1000 ， R 代表樣品和標準V-PDB 中 ¹³CI¹²C 的豐度比。

1. 2. 3 樣品的 δ¹³C 值分析

采用GC-C-IRMS分析牛肉樣品中睪酮和去氫表雄酮的 δ¹³C 值。采用GC分離1.2.1節(jié)中制得的提取凈化液，睪酮和去氫表雄酮順序進入氧化反應管，高溫下均被氧化成二氧化碳氣體，再順序進入IRMS儀器進行碳同位素分析。

GC條件采用AgilentDB-5MS色譜柱（ 60m×0.32mm ， 0.25μm ）進行分析。載氣為氮氣，流速1mL/min ，恒流模式；進樣口溫度 250^qC ；升溫程序：初始溫度為 80^°C ，以 速度升至 150^°C ，保持 2min ，然后以 速度升至 250‰ ，保持 5min ，最后以 速度升至 275‰ ，保持30min ；不分流進樣；進樣量為 2μL ；燃燒爐溫度為 1000^°C 。

質譜條件同1.2.2節(jié)的質譜條件，但質譜儀質量歧視效應采用IAEA600校正。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

本研究采取的前處理操作見1.2.1節(jié)。我國檢驗檢疫行業(yè)標準 SN/T4892—2017[23]采用衍生化方法，利用乙酸酐將睪酮衍生為睪酮乙酸酯。睪酮分子中的 17β -羥基（ 17β/Ω -OH）是主要的反應位點，與乙酸酐反應，加合一個碳原子，即衍生化產(chǎn)物辜酮乙酸酯中引入了來自乙酸酐的碳原子，實際上造成了待測物質的同位素污染。即使按照SN/T4892— 2017^[23] 規(guī)定的方法進行修正，也難以確保數(shù)據(jù)的準確性。另外，同位素修正需要分析樣品中睪酮、衍生產(chǎn)物睪酮乙酸酯和衍生化試劑乙酸酐的碳同位素組成，大大增加了工作量、延長了實驗周期、增加了實驗成本。

為避免引入外源性碳原子，提高待測樣品中碳同位素分析結果的準確性，本研究采用無需衍生的分析方法，發(fā)現(xiàn)采用GC檢測睪酮和去氫表雄酮的靈敏度很高， 100μg/mL 溶液可獲得 10000mV 以上的信號強度，信噪比達到50：1，滿足分析要求。另外，采用固相萃取能夠保證萃取液凈化效果良好，而制備色譜凈化處理方式耗時耗力。因此，本研究為了簡化樣品前處理流程，采用固相萃取替代制備色譜，并且不采用衍生化過程。前處理條件的對比見表1。

本研究提出的前處理方式顯著縮短了實驗周期，避免了待測物質的可能污染，降低了實驗成本。經(jīng)加標回收實驗計算，本方法對睪酮的回收率為 102.5% ，去氫表雄酮的回收率為 91.9% ，滿足分析要求。

2.2 檢測條件的優(yōu)化

比較了HP-5MS（ 30m×0.25mm ， 0.25μm 和DB-5MS（ 60m×0.32mm ， 0.25μm ）兩種氣相色譜柱分離效果及出峰時間的差異，結果表明，二者的出峰時間相近，但DB-5MS色譜柱柱長 60m ，能夠更好地分離目標物，且峰形較好，分離效果明顯更佳，去氫表雄酮和辜酮的保留時間差達到 200s ，而采用HP-5MS色

譜柱時二者保留時間差為 90s 。

牛肉樣品基質復雜，溫度和升溫程序等對高效分離目標物至關重要。采用選定的色譜柱，對分離溫度及升溫程序進行了優(yōu)化。實驗發(fā)現(xiàn)，當色譜柱溫度低于 150^qC 時，信號強度較低；當色譜柱溫度高于250^qC 時，信號明顯增強。為保證待測組分高效揮發(fā)，應設定適宜的進樣口溫度和色譜柱溫度。溶劑等低分子量物質可在較低溫度下?lián)]發(fā)，辜酮、去氫表雄酮和咖啡因等需要較高的溫度才有較高的揮發(fā)效率，而牛肉中可能存在殘余脂肪等大分子化合物，需要更高的溫度才能揮發(fā)，因此，應針對不同熔點和沸點的物質設定逐步升溫程序，順序分離。通過多次實驗對比，最終確定的最佳程序見1.2.3節(jié)。為保護儀器和保證樣品測量結果的準確度和精密度，在分析程序運行伊始即開始色譜柱后反吹，用氨氣吹走溶劑和基體雜質，吹掃時間為 800s 。圖1為IAEA600咖啡因、去氫表雄酮和睪酮3種標準物質/標準品的GC色譜圖，其保留時間分別為1036、1682和1879s。同時，采用陰性牛肉樣品加標的方法，進一步確認了去氫表雄酮和睪酮的分離效果。如圖2所示，牛肉樣品中去氫表雄酮和睪酮的分離效果良好，沒有雜峰干擾。

考察了4種牛肉樣品和1種牛肉粉末樣品的提取物在保留時間1040s附近的基線背景。如圖2中的插圖所示，在 1030～1050s 保留時間范圍內，均未發(fā)現(xiàn)明顯的雜峰，而且背景基線約為 210mV ，與整個分析過程的基線水平相當。

本研究采用易溶于有機溶劑（如甲醇）的高純咖啡因IAEA600作為標準物質校準質譜儀的質量歧視。由圖1可知，咖啡因的出峰時間和待測組分去氫表雄酮和睪酮的差異較大，不影響待測組分的分析。而且，樣品提取液中的咖啡因的出峰位置附近未出現(xiàn)雜峰。因此，可以在牛肉樣品的提取液中加入咖啡因標準物質，實現(xiàn)標準物質和待測組分同時分析。這種方法既可以實現(xiàn)分析系統(tǒng)的實時校正，達到內標的效果，保證去氫表雄酮和睪酮的 δ¹³C 值更準確，測量重復性更高，又可以大幅縮短分析時間，降低實驗的經(jīng)濟成本和時間成本。

采用優(yōu)化后的色譜分離條件和標準物質/待測組分同時分析技術，通過加標回收實驗分析了睪酮和去氫表雄酮中的 δ¹³C 值。分別平行測量加標后的睪酮和去氫表雄酮樣品各5次，對測得的 δ¹³C 值取平均值，結果表明，睪酮和去氫表雄酮的檢測精密度均為 0.02‰ ，表明本方法具有良好的重復性。

2.3 鑒別模型的建立

考慮到進行內源性和外源性鑒別所依據(jù)的分析數(shù)據(jù)通常較少，可以采用數(shù)據(jù)一致性判別方式，借助數(shù)學模型評估樣品組和標準組兩組數(shù)據(jù)之間是否存有差異。將預先獲得外源性（或內源性）物質的 δ¹³C 值作為標準組數(shù)據(jù)，可疑樣品的 δ¹³C 值作為樣品組數(shù)據(jù)，通過公式（1）判斷樣品中興奮劑的來源：

其中， y₁^model 為標準組的 δ¹³C 值； y₂^sample 為樣品組的 δ¹³C 值； u₁^model 為標準組 δ¹³C 值測量結果的不確定度； 為樣品組 δ¹³C 值測量結果的不確定度; k 為擴展因子，可由反興奮劑檢測組織根據(jù)需要和實際情況設定，通常為2。

如果樣品測量結果與標準組測量結果的差值小于合成擴展不確定度，則認為數(shù)據(jù)間無差異；反之，則認為數(shù)據(jù)間差異明顯。本研究中睪酮和去氫表雄酮均為外源性來源。如果差值小于合成擴展不確定度，則認為樣品中辜酮和去氫表雄酮來源為外源性；如果差值大于合成擴展不確定度，則認為樣品中辜酮和去氫表雄酮來源為內源性。

2.4牛肉中內源性、外源性辜酮和去氫表雄酮的鑒別

2.4.1 外源性睪酮和去氫表雄酮數(shù)據(jù)的收集

興奮劑藥物有多種制備方法，主要包括合成法和提取法等。辜酮通常由硼氫化鈉或硼氫化鉀還原雄烯二酮制備[24]，或微生物法轉化雄甾烯二酮[25]而成。去氫表雄酮以4-雄烯-二酮為原料、乙酰氯和醋酐為烯酯化試劑，通過吡啶鹽酸鹽催化、硼氫化鉀還原和鹽酸水解制備而成[26]。

由制備方法可知，合成法與人體自身的生物化學過程完全不同，因此，生成物具有不同的碳同位素組成。即工業(yè)制備的睪酮和去氫表雄酮的碳同位素組成與內源性物質具有明顯區(qū)別。市場上大批量銷售的睪酮和去氫表雄酮等純品和標準品由工業(yè)法制備而成，本研究將其作為外源性物質使用。

采用1.2.2節(jié)的方法分析了所采集的睪酮和去氫表雄酮標準品的碳同位素組成，測量結果用NIST8573、NIST8540和NIST8542擬合線性標準曲線校正，分別得到睪酮和去氫表雄酮中 δ¹³C 值。10份睪酮標準品的 δ¹³C 值的平均值為 -29.44‰ ，標準偏差（SD）為 0.80‰ ；14份去氫表雄酮標準品的 δ¹³C 值的平均值為 -30.86‰ ，SD為 0.86‰ 。此結果可作為外源性睪酮和去氫表雄酮碳同位素的基礎數(shù)據(jù)，用于鑒別其來源。

2.4.2牛肉中睪酮和去氫表雄酮 δ¹³C 值的測定

經(jīng)檢測，市售牛肉和冷凍干燥牛肉粉末中睪酮和去氫表雄酮均為陰性。選擇1份牛肉樣品，隨機選擇1.1.2節(jié)中的睪酮和去氫表雄酮標準品各1個，加標制備1份牛肉樣品，用于考察鑒別結果的準確性。

采用1.2.1節(jié)和1.2.3節(jié)的方法分析了加標牛肉中睪酮和去氫表雄酮的 δ¹³C 值。樣品處理后，向提取液中添加IAEA 600，采用GC-C-IRMS方法順序分析樣品中咖啡因、去氫表雄酮和睪酮的 δ¹³C 值，結果見表2。

取同一份樣品分為10份，經(jīng)過相同的提取、純化和分析過程，測量結果的測量重復性分別為 0.11‰ （睪酮）和 0.13‰ （去氫表雄酮）。將此結果作為不確定度分量之一，參與合成不確定度的評定。

2.4.3 測量結果的不確定度評定

任何測量均存在測量誤差，計量學上以不確定度表示對測量結果的不能肯定程度或可信賴程度[27]。在報告測量結果時，應給出相應的不確定度，便于使用者評估其可靠性。不確定度來源包含樣品處理和分析條件等諸多因素，本研究的不確定度來源主要包括測量重復性、標準物質的不確定度以及樣品處理等環(huán)節(jié)。綜合考察了EA-IRMS分析睪酮和去氫表雄酮標準品的 δ¹³C 值的不確定度，兩類標準品的 δ¹³C 測量值和不確定度見表3。

在表3中，標準物質引入的不確定度采用與其量值最接近的NIST8540的不確定度。下面將討論標準曲線引入的不確定度計算過程。

通過公式（2）計算標準曲線的不確定度：

其中， u（δ¹³C₀） 為標準曲線的不確定度， a 為標準曲線的斜率， s 為多次測量結果的標準偏差， p 為樣品重復測量的次數(shù)， n 為標準曲線校準用標準物質測量的總次數(shù)， δ¹³C₀ 為最終樣品的 δ¹³C 值， 為標準曲線校準用的多種標準物質的 δ¹³C 標準值的平均值， x_j 為標準曲線校準用的第 j 種標準物質的 δ¹³C 標準值。

根據(jù)標準曲線的不確定度和最終樣品的 δ¹³C 值計算標準曲線的相對不確定度：

測量結果用NIST8573、NIST8540和NIST8542擬合線性標準曲線。其中，標準物質引人的不確定度選用NIST8540的不確定度進行計算，這是因為該標準物質與目標物的 δ¹³C 值最接近，對樣品測量提供的權重最大。同時，計算標準曲線引入的不確定度，最終確定睪酮和去氫表雄酮標準品中 δ¹³C 值及不確定度分別為 -29.44%±0.81%0（k=1） 和 -30.86%±0.87%0（k=1） ，如表3所示。

2.4.4 內源性或外源性鑒別

通過2.3節(jié)建立的鑒別模型，將外源性睪酮和去氫表雄酮中碳同位素數(shù)據(jù)和牛肉中睪酮和去氫表雄酮中碳同位素數(shù)據(jù)進行處理和比較，結果見表4。

根據(jù)公式（1）可知，對于睪酮， ，而 ，因此，此牛肉樣品中的睪酮為外源性物質添加；對于去氫表雄酮 而 k=2） ，因此，此牛肉樣品中去氫表雄酮也為外源性物質添加。由2.4.2節(jié)可知，此牛肉樣品實際為加標制得，辜酮和去氫表雄酮均為外源性物質，上述判定結果與預期相符。

3 結論

建立了一種無需衍生化、基于固相萃取的高效樣品前處理方法，并建立了標準物質和待測組分同時測量的GC-C-IRMS方法。利用EA-IRMS測定了睪酮和去氫表雄酮標準品的 δ¹³C 值，初步積累了外源性辜酮和去氫表雄酮中碳同位素數(shù)據(jù)，建立了測量結果不確定度評估方法和外源性或內源性物質鑒別模型，通過數(shù)據(jù)比對和不確定度評估，對牛肉中睪酮和去氫表雄酮的來源進行鑒別并得到了初步驗證。本研究是對內外源性違禁物質鑒別的有益嘗試，所建立的提取和分析鑒別方法能夠有效區(qū)分牛肉中辜酮和去氫表雄酮的天然內源性來源和外源性添加來源，為保障食品安全和監(jiān)管提供了重要的技術支持。

References

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Identification of Endogenous and Exogenous Testosterone and Dehydroepiandrosterone in Beef by Gas Chromatography Combustion Isotope Mass Spectrometry

ZHAO Bo1， CHEN Huan-Huan1， CAI Wei1， LU Hai*1， JIANG Jie2， XING Teng1， GAO Yan1， LIN Li2， LI Wei2 1（Division of Chemical Metrology and Analytical Science， National Institute of Metrology， Beijing 100029， China） ² （Key Laboratory of Key Technologies for Major Comprehensive Guarantee of Food Safety， State Administration for Market Regulation， Beijing 1Ooo94， China）

AbstractAccurate identification of endogenous and exogenous substances in food，particularly in competition supplies，iscrucialfor ensuringfood safetyandfaircompetition，as wellas for protecting the legitimate rights and professional reputations of athletes.Testosterone （T） and dehydroepiandrosterone （DHEA） are important steroid hormones that can stimulate protein synthesis，increase the number and volume of muscle cells，and promote muscle growth and recovery.Both are often illegally used in the animal husbandry industry to promote animal growth and improve meat quality. However，current research in this area remains limited，and identification technologies require further investigation.This study focused on the techniques for identifying endogenous and exogenous hormones including Tand DHEA in beef.A Soxhlet extraction method was established，reducing the pretreatment cycle to 110min while achieving high extraction efficiency， with recovery rates of 102.5% for T and （20號 91.9% for DHEA， respectively. Based on this，a gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry （GC-C-IRMS） method was developed for analyzing carbon isotopes in T and DHEA，eliminating the need for derivatization.Byadding reference materials to the extract，simultaneous measurement ofreference materials and target analytes was achieved.The measurement of caffeine reference material，Tand DHEA was completed within 40min ， with a measurement repeatability of 0.02‰ .The δ¹³C values of Tand DHEA in standard substances， which may serve as exogenous additives，were determined using elemental analysis-isotope ratio mass spectrometry （EA-IRMS）. The results indicated an average δ¹³C value of -29.44%0±0.81% （ k=1 ）for 10T standards and -30.86%0±0.87%0 （k=1）for 14 kinds of DHEA standards.This approach effectively distinguished between endogenous sources and exogenous addition of these two hormones in beef， thereby providing vital technical support for the assurance and supervision of food safety.

KeywordsTestosterone; Dehydroepiandrosterone; Beef; Endogenous; Exogenous; Identifying