Determination of Residual Sodium Pentachlorophenol in Fresh Eggs by GC-MS/MS Method

CHE Zhiwei， LIU Wenwu， HUANG Siying （Guangzhou Jinzhi Testing Technology Co.， Ltd.， Guangzhou 511450， China）

Abstract： A method for determining residual sodium pentachlorophenol in fresh eggs using gas chromatographytandemmass spectrometry（GC-MS/MS）is established.This article purifies interfering substances through specific pretreatment steps，derivatizes with acetic anhydride pyridine solution，and determines by GC-MS/MS，quantifies by internal standard method. The results show that the method has good linearity， with a recovery range of 86% to 106% relative standard deviation of 3.3% 10 8.3% ， and a quantification limit of 0.2μg?kg^-1 . It is more sensitive than existing national standard methods and can meet the daily detection needs of egg products.

Keywords： sodium pentachlorophenol; fresh eggs; gas chromatography-tandem mass spectrometry （GC. MS/MS）

五氯酚鈉屬于有機(jī)氯類(lèi)農(nóng)藥范疇，在自然界中降解緩慢，可通過(guò)飼料等渠道侵入家禽機(jī)體并蓄積，進(jìn)而使蛋類(lèi)產(chǎn)品中殘留該物質(zhì)，對(duì)人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。2019年12月27日，五氯酚酸鈉被正式納入食品動(dòng)物中嚴(yán)禁使用的藥品及其他化合物名錄。目前，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜質(zhì)譜法等均是使用外標(biāo)法對(duì)五氯酚進(jìn)行定量，對(duì)人員操作要求較高[1-3]，其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法僅適用于肉類(lèi)食品，對(duì)樣品的預(yù)處理過(guò)程多采用固相萃取和凝膠色譜凈化法，實(shí)驗(yàn)步驟較為煩瑣復(fù)雜，且凈化不完全時(shí)極易引起基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確。加之肉制品與鮮蛋類(lèi)食品中的基質(zhì)成分存在較大差異，鮮蛋的成分構(gòu)成較為繁雜，其自身本底對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的干擾作用顯著。因此，本文研究了一種適用于鮮蛋中五氯酚鈉殘留量的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GasChromatography-

TandemMassSpectrometry，GC-MS/MS）測(cè)定方法，以期能滿足蛋類(lèi)食品日常五氯酚鈉殘留量的檢測(cè)要求[4-5]。

1材料與方法

1.1 試劑和儀器

衍生試劑（乙酸酐與吡啶的體積比為 1：1 ）現(xiàn)配現(xiàn)用； 0.2mol?L^-1 碳酸鉀水溶液； 5% 三氯乙酸水溶液、濃硫酸。實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

8890-700D型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；電子天平（萬(wàn)分之一），北京賽多利斯天平有限公司；JW-3024HR高速冷凍離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；XW-80A漩渦混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；HWS-26型恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品（五氯酚和2，4，6-三溴酚），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.2樣品前處理步驟

① 樣品提取。準(zhǔn)確稱取鮮蛋樣品（精確到 0.001g ）于離心管中，然后加入 100μL1.0μg?mL^-12，4，6- 三溴酚內(nèi)標(biāo)、 10mL5% 三氯乙酸、 0.5mL10% 硫酸、10mL 正己烷，振搖提取 1min ， 8 000r?min^-1 離心3min ，取上層有機(jī)相 2mL 于另一離心管中，加入0.5mL 濃硫酸，渦旋混勻 1min ， 8 000r?min^-1 離心3min ，取 1mL 上清液待海生。 ② 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制。分別移取10、50、100、 200μL 和 500μL 濃度為 100ng?mL^-1 五氯酚標(biāo)準(zhǔn)液于 10mL 容量瓶，分別加入 100μL1.0μg?mL^-12，4，6- 三溴酚內(nèi)標(biāo)液，用正已烷定容，配制成濃度為 0.1?0.5?1.0，2.0ng?mL^-1 和 5.0ng?mL^-1 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各取 1mL 按衍生步驟操作。 ③ 衍生。上述試樣提取液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中加入衍生試劑 0.2mL ，密封，于 60^°C 水浴反應(yīng) 15min ，取出冷卻室溫，加 0.2mol?L^-1 碳酸鉀溶液 2mL ，渦旋 1min ，注意會(huì)產(chǎn)生 CO₂ ， 8000rmin^-1 離心 2min ，取有機(jī)相，供GC-MS/MS測(cè)定。同時(shí)，用空白樣品做空白實(shí)驗(yàn)。

1.3儀器條件

色譜柱： HP-5MS 毛細(xì)管色譜柱（ 30m× 0.25mm ， 0.25μm ）；進(jìn)樣口溫度： ；載氣：氨氣（ ?99.999% ）；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量： 1μL ；柱流量： 1.0mL?min^-1 ；升溫程序：初溫80°C ，保持 2min ，以 10^°C?min^-1 升至 290^°C ，保持 4min ；傳輸線溫度： 280‰ ；電離模式：電子轟擊電離源，能量 70eV ；離子源溫度： 230^qC ；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，監(jiān)測(cè)離子對(duì)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1pH值調(diào)節(jié)溶液的選擇

樣品中的五氯酚常以其鈉鹽的形式存在，而五氯酚鈉難溶于有機(jī)試劑正己烷，可通過(guò)調(diào)節(jié)pH值至酸性的方式，使其中的五氯酚鈉轉(zhuǎn)化為五氯酚，再用正己烷進(jìn)行提取。本文分別研究了在樣品中加入不同酸性調(diào)節(jié)試劑（濃鹽酸、濃硫酸和濃硝酸）對(duì)提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入 0.5mL 的濃鹽酸，會(huì)導(dǎo)致本底有較高的響應(yīng)，而加入 0.5mL 的濃硫酸和0.5mL 的濃硝酸，會(huì)導(dǎo)致樣品出現(xiàn)碳化現(xiàn)象，使提取不充分。因考慮到使用正己烷提取后需使用濃硫酸進(jìn)行磺化去除蛋黃磷脂等雜質(zhì)，為避免向體系中引入更多雜質(zhì)，故選用 10% 的稀硫酸進(jìn)行溶液pH值調(diào)節(jié)。

2.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

內(nèi)標(biāo)物必須是試樣中不存在的物質(zhì)，應(yīng)當(dāng)是純凈的已知化合物，且內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)組分需具備基本相近或盡可能一致的物理化學(xué)特性（如沸點(diǎn)、極性、化學(xué)結(jié)構(gòu)等）、色譜表現(xiàn)及響應(yīng)特性；必須能夠完全溶解于待測(cè)樣品或溶劑里，且不與待測(cè)樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)要與試樣中各組分的色譜峰實(shí)現(xiàn)完全分離；色譜峰的出峰位置與被測(cè)組分色譜峰位置相近。經(jīng)篩查，選擇五氯苯酚 -¹³C₆ 同位素標(biāo)記物、2，4-二溴酚、2，4，6-三溴酚這3種內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行考察。其中，五氯苯酚 -¹³C₆ 與五氯酚物理化學(xué)性質(zhì)最相似，并且出峰時(shí)間一致，為 14.860min ；2，4，6-三溴酚出峰時(shí)間為 13.948min ，2，4-二溴酚出峰時(shí)間為11.613min 。但考慮到五氯苯酚 -¹³C₆ 同位素標(biāo)記物制作成本較高，而2，4，6-三溴酚較2，4-二溴酚與五氯酚的物理化學(xué)性質(zhì)更相似，出峰時(shí)間更接近，故綜合考慮選擇2，4，6-三溴酚作為本方法的內(nèi)標(biāo)化合物。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

依據(jù)五氯酚衍生物的全掃描質(zhì)譜圖分析，在一級(jí)質(zhì)譜里，目標(biāo)化合物呈現(xiàn)的特征離子涵蓋 308m/z 268m/z ， 266m/z 以及 264m/z 。其中， 266m/z 離子的強(qiáng)度最為突出，而 308m/z 雖質(zhì)荷比數(shù)值最大，然而其豐度卻相對(duì)較小，故選 266m/z 作為二級(jí)質(zhì)譜的母離子。根據(jù) 266m/z 的二級(jí)質(zhì)譜，子離子選擇167m/z 7 202m/z 1 230m/z 。內(nèi)標(biāo)物2，4，6-三溴酚的衍生物根據(jù)全掃描質(zhì)譜圖選擇強(qiáng)度最大的 330m/z 特征離子作為二級(jí)質(zhì)譜的母離子，子離子則選擇 141m/z 、222m/z 。研究不同的碰撞誘導(dǎo)電離（CollisionInducedDissociation，CID）碰撞電壓下的子離子強(qiáng)度，五氯酚的衍生物質(zhì)譜條件選擇為 266gt;167 （37V）， 266gt; 202（21V）， 266gt;230 （17V）；內(nèi)標(biāo)物 2，4，6- 三溴酚的衍生物質(zhì)譜條件選擇為 330gt;141 （49V），330gt;222（29V）

2.4線性關(guān)系

取上述衍生后的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上機(jī)測(cè)試，以特征離子對(duì)與內(nèi)標(biāo)特征離子對(duì)色譜圖峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲

線（圖1），線性方程為 y=0.231 141 4x+0.001 994 R²=0.99991852 ，說(shuō)明線性關(guān)系良好。方法定量限以10 倍信噪比計(jì)算，本方法定量限為 0.2μg?kg^-1 。

2.5 回收率與精密度試驗(yàn)

稱取陰性樣品低、中、高3組各6份，每份各5g 鮮蛋樣品，低組加入五氯酚 1ng 、中組加入五氯酚 2ng 、高組加入五氯酚 10ng ，按上述步驟進(jìn)行處理測(cè)試，測(cè)試結(jié)果回收率和精密度見(jiàn)表2?；厥章蕿?86%～106% ；重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RelativeStandardDeviation，RSD）為 3.3%～ 8.3%

3結(jié)論

本文建立的檢測(cè)方法測(cè)試蛋類(lèi)試樣中五氯酚含量定量限可達(dá) 0.2μg?kg^-1 ；相較于《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物源性食品中五氯酚殘留量的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜法》（GB23200.92—2016）所規(guī)定的定量限（ 1.0μg?kg^-1 ），其數(shù)值更低，能滿足蛋類(lèi)食品日常五氯酚鈉殘留量的檢測(cè)要求。本文研究了一種適用于鮮蛋中五氯酚鈉殘留量的GC-MS/MS測(cè)定方法，通過(guò)優(yōu)化前處理步驟、衍生化條件及儀器參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)鮮蛋中五氯酚鈉的高靈敏度檢測(cè)。該方法具有線性關(guān)系良好、回收率高（ 86%～106% ）、重復(fù)性好（ 3.3%～8.3% ）等優(yōu)點(diǎn)，定量限低于現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，能滿足蛋類(lèi)食品日常檢測(cè)需求。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物性食品中五氯酚鈉殘留量的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法：GB29708—2013[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[2]阮鑫，陸春波，屈健.畜禽產(chǎn)品中五氯酚酸鈉殘留危害與分析[J].中國(guó)畜禽種業(yè)，2022，18（1）：54-56.

[3]陳彥宏，毛新武，胡凌，等.LC-MS/MS法測(cè)定動(dòng)物源性食品中五氯酚殘留量的關(guān)鍵控制點(diǎn)分析[J]現(xiàn)代食品，2024（21）：182-187.

[4]廖偉杰，黃兆翔，高佳敏.優(yōu)化液質(zhì)法測(cè)定多種基質(zhì)中五氯酚殘留量[J].廣州化學(xué)，2024，49（3）：66-69.

[5]周濤，陳志民，付麗紅，等.HPLC-MS/MS快速測(cè)定蜂蜜中五氯酚殘留[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，65（3）：685-688.