中圖分類號：S666；S436.66 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2025）06-1269-12

Abstract： 【Objective】 Citrus tatter leaf disease is a viral disease that harms citrus trees.Currently，it is showing an increasing trend of spreading and causing plant weakness，death，and even large-scale destruction of orchards. It has become an important obstacle to the sustainable development of the citrus industry.The aim of this study was to clarify the occurrence and distribution of citrus tatter leaf disease in Zhejiang Province，as wellas the diversity and genetic differentiation of its pathogen，and to explore the origin and evolution of citrus tatter leaf virus （CTLV）.【Methods】From 2019 to 2022，we continued to investigate the occurrence of citrus tatter leaf disease through observing and recording the symptoms of the disease in various citrus production areas in Zhejiang Province.The 46 citrus varieties included Ehime Kashi No.28，Haruka，Mantouhong，Himekoharu etc. For the detectionof citrus tatter leaf virus， total RNA of the samples was extracted， and RT-PCR amplification was performed with specific primers. The amplification results were detected by agarose gel followed by observation and photography. The target band on the agarose gel was cut off and then the PCR products were recovered using a DNA gel recovery kit folowed by a bidirectional sequencing. After aligning the obtained sequences， the similarity of the nucleotide and amino acid sequences of the coat protein genes from diferent samples

WeIt aHaIyzcu. AII uIu sequUHUC IUIauUII WeIt suUueu ItU UUHDaIK WeUsIt aIu WeIc aIsU uscu to construct a phylogenetic tree using the neighbor-joining method of MEGA 5.05 software.【Results】 The results of field investigations showed that the symptoms of citrus tatter leaf disease were generally similar among different citrus varieties.The infected trees usually grew slower and the tree vigor was weaker than the healthy trees. The leaves of the diseased tree showed a systematic slight yellowing at the initial stage and gradually worsened. In the later stages，the leaves became severely yelowed and gradually fell offrom the tree，resulting in few or even no fruits.Finally，the entire tree died. When the diseased trees were subjected to strong winds or external forces，the graft union of diseased trees was prone to break，and the cracking surface was smooth. Out of the 951 collected citrus samples，311 samples were infected with the disease， with a positive detection rate of 32.70% . Apart from Huzhou city， the disease was found to be widely distributed in various citrus production areas in Zhejiang Province. There were also significant differences in the positive detection rates among different counties or districts within the same region.Froma variety perspective，out of the tested 43 citrus varieties，27 showed positive results. The positivity rate of Tangor type was 48.54% ， significantly higher than the Tangelo type （12.33% ），Pummelo type（ （16.54% ），Tangerine type （16.22% ），andMandatory type （13.85% ）， while the positivity rate of Grapefruit type was relatively low. Within the same type，there were also significant diffrences in the positivity rates of different cultivars.The constructed phylogenetic tree based on the coat protein gene sequence of CTLV showed that allthe 144 isolates were clearly divided into two major branches.The first major branch contained 98 isolated samples，and the second contained 46 isolated samples.From the perspective of townships，the isolates from 31 townships distributed in the first branches，while 21 townships samples distributed in the second branches，and the isolates from 16 townships distributed in both branches.From the perspective of counties，15 and 10 counties-isolates distributed in the first and second branches，respectively，and the isolates from 8counties distributed in both branches.From the perspective of cities，the first major branch included the isolates from all of the 8 cities in Zhejiang Province，while the second included the isolates from 6 cities.The two major branches were further divided into 12 secondary branches，and the collected samples from Zhejiang Province were distributed in every branch.The samples collected from Taizhou City were also widely distributed in multiple secondary branches.From the perspective of citrus cultivars，among the isolates from 46 citrus cultivars，the isolates from 36and 22 cultivars had clustered in the first and second major branch，respectively. The isolates from 12 cultivars had distributed in both branches.Among them，36 and 21 isolates of the most abundant variety，Ehime Kashi No.28，had clustered in the two major branches，respectively. From the perspective of the citrus types，10 citrus types were distributed in the first major branch，while the second included 9 types.Among them，the distribution number of the isolates of Tangor type which had the highest quantity were 55 and 26 in the two major branches，respectively. 【Conclusion】 The occurrence of citrus tatter leaf disease was common in citrus production areas in Zhejiang Province，and it widely harms different citrus types and cultivars.The pathogen population showed rich genetic diversity， but there was no obvious correlation between its differentiation and geographical isolation or host varieties.The results of this study would provide areference for further exploration of the origin，systematic evolution and pathogenic differentiation of the CTLV.At the same time，it sems to be possble that the proper procedure of variety introduction and nursery tree transportation would be the key to prevent the occurrence of the disease.

Key Words： Citrus tatter leaf disease; Occurrence; Distribution; Detection; Coat protein gene; Genetic diversity

柑橘病毒類病害是指由病毒和類病毒等病原物侵染柑橘引起的一類病害，世界上已報(bào)道的此類病害有80余種，具有易傳播擴(kuò)散、常潛伏侵染、復(fù)合侵染率高、樹體終生帶毒、危害周期長和難以防治等特點(diǎn)[-2]，而柑橘衰退病、柑橘碎葉病、柑橘裂皮病、溫州蜜柑萎縮病、柑橘黃脈病等在中國發(fā)生較為普遍，其中尤以柑橘碎葉病危害嚴(yán)重。自1962年首次在從中國引進(jìn)到美國加州的北京檸檬上發(fā)現(xiàn)該病害以來，目前已廣泛分布在中國、美國、日本、澳大利亞和南非等多個(gè)柑橘主產(chǎn)國[4。

浙江柑橘碎葉病最早于20世紀(jì)70年代由日本防疫所在從黃巖引進(jìn)的本地早、乳橘、碰柑等品種上發(fā)現(xiàn)，80年代中期，張?zhí)祉档韧ㄟ^指示植物鑒定出在黃巖栽培的本地早、幔橘、乳橘、早橘等10個(gè)品種感染柑橘碎葉病。90年代初，謝佩華等又在溫州地區(qū)的柳橙、柱柑、四季柚等8個(gè)品種上檢測到柑橘碎葉病。此后，陸續(xù)有關(guān)于浙江省柑橘碎葉病的研究報(bào)道。盡管如此，或是因?yàn)槎鄶?shù)柑橘品種存在隱癥現(xiàn)象、葉片黃化易與生理性病害相混淆、嫁接口處“腫大\"癥狀常被視為砧穗不親和等，柑橘碎葉病在生產(chǎn)中未引起人們足夠的重視。近年來，隨著紅美人等優(yōu)新雜柑品種的興起，苗木的不規(guī)范化繁育和無序調(diào)運(yùn)問題愈發(fā)突出，致使柑橘碎葉病呈加重蔓延的趨勢，植株衰弱、枯死乃至大面積毀園的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，已成為柑橘產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要障礙。

柑橘碎葉病的病原物為柑橘碎葉病毒（citrustatterleafvirus，CTLV），是線性病毒科（Closteroviri-dae）發(fā)狀病毒屬（Capillovirus）的正義單鏈RNA病毒。鑒于形態(tài)學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)特性上的密切相關(guān)性，CTLV被認(rèn)為是蘋果莖溝病毒（applestemgroovingvirus，ASGV）的一個(gè)株系，其基因組大小約 6.5kb ，包含ORF1（ 和ORF2（1.0kb）兩個(gè)重疊的開放閱讀框，其中ORF1編碼一個(gè)分子質(zhì)量為 241ku 的多聚蛋白，外殼蛋白位于其C端，大小約為 。已有研究表明CTLV不同分離物存在較豐富的遺傳多樣性[4，9-12]，其外殼蛋白基因序列在強(qiáng)、弱毒分離物之間存在差異[3]，但其與地理來源和寄主品種的相關(guān)性方面不同的研究結(jié)果不盡相同，對于浙江省不同產(chǎn)區(qū)和柑橘品種特別是紅美人等雜柑品種上CTLV的遺傳變異尚未見有系統(tǒng)的研究報(bào)道。

筆者在本研究中通過持續(xù)多年的跟蹤調(diào)查，明確柑橘碎葉病在浙江省的發(fā)生分布情況，并通過序列分析探究CTLV的遺傳多樣性及其與地理來源和寄主的相關(guān)性，以期為進(jìn)一步研究CTLV的系統(tǒng)演化、致病性分化及開展對柑橘碎葉病的有效防控提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

植物材料：柑橘葉片樣品多數(shù)采集于、麗水、寧波、金華、溫州、衢州、嘉興、舟山、杭州和紹興等地，少量采集于廣東陽江、廣西桂林、云南大理、云南紅河、四川成都和上海崇明等地。柑橘品種包括紅美人、媛小春、滿頭紅、晴姬、091無核沃柑、碰柑、甘平、由良溫州蜜柑、宮川溫州蜜柑、尾張溫州蜜柑、佛手、春香、興津60、黃美人、砂糖橘、四季柚、明日見、貢柑、茂谷柑、香水檸檬、甜橘柚和沃柑等。

主要試劑：總RNA小量制備試劑盒AP-MN-MS-RNA-250和DNA凝膠回收試劑盒AP-GX-250購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司，一步法RT-PCR試劑盒PrimeScriptTMOneStepRT-PCRKitVer.2購自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂糖品牌為西班牙Biowest，核酸染料GelRed為美國Biotium公司產(chǎn)品。

引物：對GenBank中已登錄的不同地理來源和寄主品種的柑橘碎葉病毒基因序列進(jìn)行比對分析，選取保守區(qū)域設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增外殼蛋白基因全長的引物CTLV-Fn（5'-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3'）和CTLV-Rn（5'-AGAGTGGACAAACTCTAGAC-3），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2病害調(diào)查與樣品采集

2019一2022年，持續(xù)在浙江省各柑橘產(chǎn)區(qū)調(diào)查柑橘碎葉病發(fā)生情況，觀察并記錄病害癥狀，從疑似病樹上或隨機(jī)選取的橘樹上剪取帶有3＼～5枚葉片的枝條，置于塑料自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室后立即處理或暫存于 4^°C 冰箱中。

1.3病原一步法RT-PCR檢測

稱取 0.1g 柑橘葉片組織放入 2mL 塑料研磨管中，置于冷凍研磨儀中在 -49^°C 條件下將樣品研磨粉碎，然后以總RNA小量制備試劑盒提取樣品總RNA，最后將制得的RNA溶解在TE緩沖液中備用。以樣品總RNA為模板，以特異性引物CTLV-Fn/CTLV-Rn進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：

模板RNA 1μL，2× One Step Mix 25μL ，One StepEnzyme Mix 2.5μL ，引物CTLV-Fn 0.5μL ，引物CTLV-Rn 0.5μL ，無菌水 20.5μL ，總體積 50μL 。反應(yīng)條件為： 50^°C30min;94^°C3min;94^°C30s ，57^°C30s，72^°C1min，35 個(gè)循環(huán)； 。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物上樣于 1.5% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。若樣品泳道出現(xiàn)與陽性對照大小一致的條帶，且陰性對照和空白對照無對應(yīng)條帶，則視為陽性；若樣品泳道未出現(xiàn)與陽性對照大小一致的條帶，且陰性對照和空白對照無對應(yīng)條帶，則視為陰性。

1.4外殼蛋白基因測序分析

在紫外切膠儀中切取瓊脂糖凝膠上的目的條帶，以DNA凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，然后送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序。去掉測序結(jié)果5末端和3末端非編碼區(qū)，僅保留完整的柑橘碎葉病毒外殼蛋白開放閱讀框全長，然后用軟件DNAstar中的MegaAlign程序?qū)π蛄羞M(jìn)行兩兩比對，分析不同分離物外殼蛋白基因核苷酸序列和氨基酸序列的相似率，并將序列信息登錄到GenBank中。用于系統(tǒng)發(fā)育分析的序列均從Gen-Bank中下載，具體登錄號為PP734420＼～PP734530，KP025652＼～KP025671，MH108975＼～MH108986，JX4-16228，MK481978，KY861873。包含在本研究中獲得的相似率低于 99% 的所有序列，同一地理來源同一品種上相似率大于 99% 的多個(gè)序列則取其中之一，共111個(gè)。從GenBank中選取已登錄的不同地理來源和柑橘品種的CTLV外殼蛋白基因序列33個(gè)，及寄主種類為蘋果的ASGV外殼蛋白基因序列1個(gè)。以發(fā)狀病毒屬的櫻桃病毒A為外群，利用MEGA5.05軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病害癥狀

對于已經(jīng)顯癥的病樹，柑橘碎葉病在不同柑橘品種上表現(xiàn)的病害癥狀大致相同，病樹通常比健樹生長緩慢，樹勢較弱，病樹上的葉片初期呈現(xiàn)系統(tǒng)性輕微黃化，之后不斷加重，至后期葉片嚴(yán)重黃化并陸續(xù)從樹體上脫落，結(jié)果少甚至不結(jié)果，最后整個(gè)植株枯死。受強(qiáng)風(fēng)或用手推拉等外力作用時(shí)，病樹的砧穗接合處易斷裂，且裂面光滑。在病樹上靠接枸頭橙等其他砧木，能在一定程度上增強(qiáng)樹勢，但葉片黃化、結(jié)果少、砧穗接合處易斷裂等現(xiàn)象不能得到徹底改善，包括病樹與靠接砧的結(jié)合部位也存在易斷裂的情況（圖1）。

2.2 病害發(fā)生分布

對采集的951份柑橘樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示有311份樣品感染柑橘碎葉病，陽性檢出率為32.70% 。從地域上來看，除湖州地區(qū)外，柑橘碎葉病已廣泛分布在浙江省各柑橘產(chǎn)區(qū)（圖2），病原物檢測陽性率 6.52%～57.14% 不等（表1），其中尤以紹興地區(qū)和寧波地區(qū)陽性檢出率最高，分別達(dá) 57.14% 和 55.91% ，其次為金華、溫州和衢州等地區(qū)，陽性檢出率分別為 42.86%，38.02% 和 35.29% ，而杭州地區(qū)陽性檢出率最低，僅為 6.52% 。在同一地區(qū)內(nèi)，不同縣（市、區(qū)）之間的陽性檢出率也存在明顯差異，如在整體檢出率為 29.40% 的臺(tái)州地區(qū)，黃巖區(qū)和溫嶺市的檢出率分別高達(dá) 54.17% 和 43.01% ，臨海市則僅為14.97% ，而三門縣14個(gè)樣品均表現(xiàn)為陰性。從品種上來看，在所檢測的43個(gè)柑橘品種（品系）中，有27個(gè)表現(xiàn)為陽性，其中柑橘屬的枸櫞類10個(gè)佛手樣品和酸橙類2個(gè)枸頭橙樣品的檢測結(jié)果均為陽性，橘橙類雜柑的陽性率高達(dá) 48.54% ，顯著高于橘柚類雜柑（ 12.33% ）、柑類（ 16.54% ）、橘類 （16.22% ）和柚類（ 13.85% ），而葡萄柚類相對較低，僅為 4.55% ，而檸檬黎檬類的4個(gè)樣品、枳屬的1個(gè)樣品和金柑屬的5個(gè)樣品均表現(xiàn)為陰性。在同一大類中，不同柑橘品種（品系）的陽性率也存在明顯差異，如在整體檢出率為 48.54% 的橘橙類雜柑樣品中，沃柑等4個(gè)品種的樣品均表現(xiàn)為陰性，甘平陽性率為 6.25% ，而金秋砂糖橘、明日見、紅美人等9個(gè)品種的樣品陽性率均在 40% 以上；在整體檢出率為 12.33% 的橘柚類雜柑樣品中，春香的檢出率高達(dá) 85.71% ，而甜橘柚的檢出率則僅為 4.55% 。

2.3 CTLV外殼蛋白基因同源性分析

測序獲得202個(gè)CTLV分離物的外殼蛋白基因序列，其核苷酸序列全長為714個(gè)堿基。分析發(fā)現(xiàn)不同地理來源不同品種CTLV分離物之間外殼蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似率分別為87.7%～100.0% 和 91.6%～100.0% ，不同地理來源相同品種上CTLV分離物之間外殼蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似率分別為 87.7%～100.0% 和92.0%～100.0% ，同一地理來源不同品種上CTLV分離物之間外殼蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似率分別為 89.2%～100.0% 和 92.0%～100.0% ，同一地理來源同一品種上CTLV分離物之間外殼蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似率分別為88.8%～100.0% 和 92.0%～100.0% 。此外，對單個(gè)樣品測序圖譜分析發(fā)現(xiàn)，有的分離物外殼蛋白基因序列中單個(gè)或多個(gè)堿基處呈現(xiàn)重疊峰，說明存在基因雜合的情況。相比較浙江省柑橘產(chǎn)區(qū)，來自云南、四川、廣東、廣西等柑橘產(chǎn)區(qū)同一地理來源同一品種上的分離物相對保守，序列相似率多為 100.0% 。

圖1柑橘碎葉病的田間病害癥狀

2.4 CTLV系統(tǒng)發(fā)育分析

基于CTLV外殼蛋白基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，在系統(tǒng)發(fā)育樹上所有144個(gè)CTLV分離物明顯地分為兩個(gè)大的分支，第一大分支包含98個(gè)CTLV分離物，及ASGV分離物Shaaxi-3；第二大分支包含46個(gè)CTLV分離物。

從地理來源以鄉(xiāng)鎮(zhèn)為單位來看，在來自浙江省36個(gè)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的分離物中，有31個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的分離物聚在第一大分支中，有21個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的分離物聚在第二大分支中，其中16個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的分離物在兩大分支中均有分布；從地理來源以縣（市、區(qū)）為單位來看，在來自浙江省17個(gè)不同縣（市、區(qū)）的分離物中，有15個(gè)縣（市、區(qū)）的分離物聚在第一大分支中，有10個(gè)縣（市、區(qū)）的分離物聚在第二大分支中，其中8個(gè)縣（市、區(qū)）的分離物在兩大分支中均有分布；從地理來源以地級市為單位來看，第一大分支包含了來自浙江省所有8個(gè)地級市的分離物，第二大分支則包含6個(gè)地級市的分離物；從地理來源以省份為單位來看，筆者在本研究中獲得的和GenBank中登錄的共10個(gè)省份的分離物均有在第一大分支中分布，其中浙江省的分離物有70個(gè)，第二大分支則包含7個(gè)省份的分離物，其中浙江省的分離物有32個(gè)。從地理來源以國家為單位來看，第一大分支包含中國的92個(gè)分離物、美國的5個(gè)分離物和日本的2個(gè)分離物，而第二大分支則僅包括來自中國的45個(gè)分離物。第一個(gè)大分支中的98個(gè)CTLV分離物又分為7個(gè)分支，浙江省的70個(gè)分離物在每個(gè)分支中均有分布，其中臺(tái)州市的32個(gè)分離物也廣泛分布在其中的6個(gè)分支中，每個(gè)分支中包含2個(gè)至多個(gè)來自不同省份的分離物，美國的5個(gè)分離物和日本的2個(gè)分離物與中國浙江、四川等地的6個(gè)分離物則聚為一個(gè)分支，而來自中國的分離物R40和TL112則與ASGV分離物Shaanxi-3具有更近的親緣關(guān)系，單獨(dú)聚為一個(gè)分支。第二個(gè)大分支中的46個(gè)CTLV分離物又分為5個(gè)分支，浙江省的32個(gè)分離物在每個(gè)分支中均有分布，其中臺(tái)州市的15個(gè)分離物也廣泛分布在其中的4個(gè)分支中，臨海市的3個(gè)分離物聚為一個(gè)分支，而浙江溫州市蒼南縣分離物R43則單獨(dú)為一個(gè)分支，其他3個(gè)分支中均包含來自不同省份的分離物。此外，每個(gè)分支下多包含2個(gè)至多個(gè)小分支及更小的分支。

從寄主品種來看，在來自46個(gè)柑橘品種（品系）的分離物中，有36個(gè)品種（品系）的分離物聚在第一大分支中，有22個(gè)品種（品系）的分離物聚在第二大分支中，12個(gè)品種（品系）的分離物在兩大分支中均有分布，其中數(shù)量最多的紅美人品種上的分離物在兩大分支中的分布數(shù)分別是36個(gè)和21個(gè)，而媛小春品種上的5個(gè)分離物和佛手品種上的4個(gè)分離物均全部聚在第一大分支中，2個(gè)砂糖橘品種上的分離物均聚在第二大分支中。從柑橘品種（品系）所屬大類來看，用于分析的所有10個(gè)柑橘大類的分離物在第一大分支中均有分布，第二大分支則包含其中的9個(gè)大類，其中數(shù)量最多的橘橙類上的分離物在兩大分支中的分布數(shù)分別是55個(gè)和26個(gè)，而酸橙類的2個(gè)分離物均聚在第一大分支中。在第一大分支下的7個(gè)分支中，除四季柚上的分離物R40和枸緣上的分離物TL112與ASGV分離物 Shaanxi-3聚為一個(gè)分支外，其他6個(gè)分支中均包含3個(gè)以上柑橘大類4個(gè)以上柑橘品種（品系）的分離物，特別是第一分支中多達(dá)7個(gè)柑橘大類17個(gè)柑橘品種（品系）。橘橙類上的55個(gè)分離物（其中紅美人品種上36個(gè)分離物）廣泛分布在6個(gè)分支中，柑類溫州蜜柑品種上的15個(gè)分離物也在其中的4個(gè)分支中均有分布，而橘橙類媛小春品種上的5個(gè)分離物和枸緣類佛手上的4個(gè)分離物分別集中聚在同一分支中。在第一分支下又分為2個(gè)小的分支，其中一個(gè)小分支中包含來自11個(gè)品種（品系）的30個(gè)分離物，但其所屬大類相對其他分支較為單一，除1個(gè)酸橙類分離物外，其余均為柑類和橘橙類。在第二大分支下的5個(gè)分支中，除柚類四季柚品種上的分離物R43單獨(dú)聚為一個(gè)分支，柑類宮川溫州蜜柑分離物SJ16R、XZ1R與橘橙類紅美人分離物SJ13R聚為一個(gè)分支外，其余3個(gè)分支均包含4個(gè)以上柑橘大類4個(gè)以上柑橘品種（品系）的分離物，其中最大的一個(gè)分支包含6個(gè)柑橘大類12個(gè)柑橘品種（品系）。橘橙類紅美人品種的分離物在4個(gè)分支中均有分布，柑類溫州蜜柑品種（品系）也廣泛分布在其中的3個(gè)分支中。

3討論

多數(shù)柑橘品種感染CTLV后通常不表現(xiàn)明顯癥狀，但以積及其雜種為砧木的柑橘植株被感染后會(huì)表現(xiàn)葉脈黃化、嫁接部位腫大易斷裂、葉片易脫落、植株矮化乃至整株枯死等病害癥狀[4.1415]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃金蜜柚、三紅柚、紅肉琯溪蜜柚等品種感染CTLV后還會(huì)表現(xiàn)新梢黃化、斑駁花葉等癥狀，在不知火品種上則會(huì)表現(xiàn)為新葉脈明癥狀，而在默科特、沃柑等品種上則會(huì)表現(xiàn)為果實(shí)變小、僵硬和不轉(zhuǎn)色癥狀[1]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，以枳殼為砧木的紅美人、媛小春等柑橘品種病害癥狀尤為嚴(yán)重，多表現(xiàn)為植株黃化矮小、葉片易脫落、砧穗結(jié)合處易斷裂和整株枯死。新葉脈明癥狀雖也有在溫州蜜柑等品種上被發(fā)現(xiàn)，但檢測發(fā)現(xiàn)其同時(shí)攜帶CTLV和柑橘黃化脈明病毒，因葉片脈明是柑橘黃脈病的典型癥狀，因此分析認(rèn)為本研究中的新葉脈明癥狀系CYVCV感染所致。此外，在CTLV侵染的部分紅美人植株上存在果實(shí)變小、僵硬等癥狀，但通過營養(yǎng)元素測定分析認(rèn)為該癥狀或是由缺硼引起（相關(guān)數(shù)據(jù)待發(fā)表），是否與CTLV侵染有相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究。

浙江省最早于20世紀(jì)70年代由日本防疫所在從黃巖引進(jìn)的柑橘品種上發(fā)現(xiàn)柑橘碎葉病，之后相繼在臺(tái)州和溫州地區(qū)檢測到該病害[5。近年來，項(xiàng)周等利用PCR技術(shù)對來自浙江省的10份樣品進(jìn)行檢測未發(fā)現(xiàn)其感染CTLV，而高海馨等[12則從浙江省46份樣品中檢出17份樣品感染有CTLV，陽性率高達(dá) 36.96% 。筆者在本研究中從來自浙江省全部11個(gè)地級市的951份樣品中檢測到10個(gè)地級市的311份樣品感染有CTLV，陽性率為 32.70% ，說明柑橘碎葉病已在浙江柑橘產(chǎn)區(qū)廣泛分布。研究還發(fā)現(xiàn)浙江省不同地區(qū)及同一地區(qū)不同縣（市、區(qū)）之間陽性率存在明顯差異，如從國外引種較為活躍的象山縣陽性率高達(dá) 54.87% ，而種植品種較為單一、引種和苗木調(diào)運(yùn)頻次較低的慶元縣則僅為 5.17% ，因此認(rèn)為從國外頻繁引種和苗木無序調(diào)運(yùn)可能是導(dǎo)致柑橘碎葉病發(fā)生蔓延的原因。

柑橘碎葉病在柑橘類植物上具有廣泛的寄主，從20世紀(jì)60年代開始，人們陸續(xù)通過指示植物鑒定出北京檸檬、溫州蜜柑、蕉柑等20余個(gè)柑橘品種感染CTLV[。20世紀(jì)以來，通過PCR或熒光定量PCR技術(shù)檢測到砂糖橘、沃柑、默科特等多個(gè)品種感染有CTLV[17-19]，特別是高海馨等[12]從七大類55個(gè)柑橘品種中檢測到了CTLV。筆者在本研究中也從浙江省八大類26個(gè)柑橘品種（品系）中檢測到了CTLV，包括溫州蜜柑、柱柑等傳統(tǒng)品種和紅美人、媛小春等新興的雜柑品種，說明該病害已在各柑橘品種中廣泛分布。筆者在本研究中檢測的枸緣類10個(gè)佛手樣品均表現(xiàn)為陽性，與高海馨研究結(jié)果一致，不同的是筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)橘橙類和橘柚類雜柑陽性率較高，達(dá) 43.74% ，而柚類陽性率僅有13.85% ，特別是水晶柚、麻步文旦、皋泄香柚等地方特色品種均表現(xiàn)為陰性，這可能與該地區(qū)種植品種較為單一、鮮有外來苗木引入從而未導(dǎo)致碎葉病傳播擴(kuò)散有關(guān)。地區(qū)檢出率的高低與其所種植的品種（品系）表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，如種植橘橙類比例較高的寧波和紹興地區(qū)較其他幾個(gè)地區(qū)有更高的檢出率，而湖州和嘉興地區(qū)盡管所檢測樣品均為橘橙類紅美人，但其檢出率卻為最低，這應(yīng)該與該地區(qū)檢測樣品數(shù)量較少或所種植苗木多為無病毒苗木有關(guān)。

已有研究表明，CTLV的CP基因相對保守，但也存在著不同程度的遺傳變異，核苷酸和氨基酸序列相似率為 88.1%～100.0% 和 91.1%～100.0% 不等，而這種變異與CTLV的來源地域、寄主品種沒有直接相關(guān)性[10.11.13]。筆者在本研究中對浙江省202個(gè)CTLV分離物的外殼蛋白基因分析發(fā)現(xiàn)，其核苷酸序列和氨基酸序列相似率分別為 87.7%～100.0% 和91.6%～100.0% ，核苷酸序列最大變異超 12% ，其變異未表現(xiàn)出與地理來源和寄主品種明顯的相關(guān)性，這與已報(bào)道的研究結(jié)果相似。有意思的是，筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)CTLV的CP基因在有的樣品中存在雜合的情況，且在不同樣品中表現(xiàn)不盡一致，說明在自然條件下存在CTLV不同株系混合侵染同一柑橘植株的現(xiàn)象，且其種群遺傳結(jié)構(gòu)會(huì)不斷發(fā)生變化，這可能與帶毒接穗在不同柑橘品種上被頻繁高接有關(guān)，與劉科宏等[的研究發(fā)現(xiàn)相符合，即CTLV接種不同柑橘品種后其CP基因核苷酸位點(diǎn)會(huì)發(fā)生變異，認(rèn)為病毒株系在不同類型柑橘上的適應(yīng)性存在差異，或是由于不同類型的柑橘在各自與病毒的共同演化過程中產(chǎn)生了不同的防御機(jī)制。

與高海馨等通過CTLV全基因組分析發(fā)現(xiàn)來自同一省份的CTLV分離物多聚在相同的分支中不同，本研究中浙江省101個(gè)分離物在系統(tǒng)發(fā)育樹中廣泛分布在不同的分支中，這與項(xiàng)周等對湖北省分離物的分析結(jié)果和張金珠等對廣西分離物的分析結(jié)果相似。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)美國的5個(gè)分離物、日本的2個(gè)分離物與浙江和四川的6個(gè)分離物聚在同一個(gè)小的分支中，由此說明不同國家的CTLV分離物呈現(xiàn)一定的地理相關(guān)性，這與張金珠等的分析結(jié)果一致，也符合CTLV起源于亞洲的論斷和起源點(diǎn)病毒序列高度多樣性的原則[4，20-21]。與高海馨等發(fā)現(xiàn)采自柚類的CTLV分離物多聚在相同的分支中不同，在本研究中，柚類分離物多分布在不同的分支中，未呈現(xiàn)明顯聚集的情況。其他柑橘大類分離物特別是橘橙類紅美人品種上的分離物廣泛分布在不同分支中，這可能與該品種在各柑橘產(chǎn)區(qū)推廣種植及在各柑橘品種上廣泛高接相關(guān)，符合CTLV接種不同柑橘品種后其基因發(fā)生變異的研究結(jié)論[15]。橘橙類媛小春品種上的5個(gè)分離物和枸櫞類佛手上的4個(gè)分離物分別集中聚在同一分支中，CTLV是否在這兩個(gè)品種上具有更高的保守性尚需要更多的分離物序列分析確定。此外，在本研究中，32個(gè)浙江分離物與宋震等[3報(bào)道的6個(gè)弱毒分離物聚在一大分支中，其余分離物與10個(gè)強(qiáng)毒分離物聚在另一大分支中，這些分離物是否存在致病性強(qiáng)弱差異尚有待進(jìn)一步研究確定。

4結(jié)論

柑橘碎葉病在浙江柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，廣泛危害不同的柑橘品種（品系），其病原物種群存在豐富的遺傳多樣性，但其分化與地理隔離和寄主品種不存在明顯的相關(guān)性。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究CTLV的起源、系統(tǒng)演化和致病性分化奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也揭示了規(guī)范化品種引進(jìn)和苗木調(diào)運(yùn)程序是預(yù)防該病害發(fā)生的關(guān)鍵。

參考文獻(xiàn)References：

[1] 張艷慧，劉瑩潔，金鑫，周彥.我國柑橘近年新發(fā)生的病毒及類 似病害研究進(jìn)展[J].果樹學(xué)報(bào)，2017，34（9）：1213-1221. ZHANGYanhui，LIUYingjie，JINXin，ZHOUYan.Progress in studyof new citrusviruses and viroids diseases in China[J]. JournalofFruitScience，2017，34（9）：1213-1221.

[2] 李月，張志標(biāo)，周玉蓉，鐘進(jìn)良，劉蕊.我國柑橘主要病毒類病 害及其脫毒技術(shù)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2020，26（8）：80- 82. LI Yue，ZHANG Zhibiao，ZHOU Yurong，ZHONG Jinliang， ogy in China[J].Anhui Agricultural Science Bulletin，2020，26 （8）：80-82.

[3] 張?zhí)祉?美國、日本對柑橘碎葉病毒病（Tatter leaf virus）的研 究[J].浙江柑橘，1989，6（1）：39-41. ZHANG Tianmiao. Study on Citrus tater leaf virus in USA and Japan[J]. Zhejiang Citrus，1989，6（1）：39-41.

[4] TANSH，OSMANF，BODAGHI S，DANGT，GREERG， HUANG A，HAMMADO S，ABU-HAJAR S，CAMPOSR，VIDALAKIS G.Full genome characterization of 12 Citrus tatter leaf virus isolates for the development of a detection assay[J]. PLoS One，2019，14（10）：e0223958.

[5] 張?zhí)祉?，梁仙友，龔祖塤，陳作義.柑橘碎葉病毒的發(fā)生與初 步鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)，1988，18（2）：17-22. ZHANG Tianmiao，LIANG Xianyou，GONG Zuxun，CHEN Zuoyi.Occurrence and detection of Citrus tater leaf virus （CTJV） in Huangyan，Zhejiang province[J]. Acta Phytopathologica Sinica，1988，18（2）：17-22.

[6] 謝佩華，金顯忠，何獻(xiàn)武.浙江南部柑橘碎葉病的調(diào)查和鑒 定[J].植物病理學(xué)報(bào)，1992，22（3）：195-196. XIE Peihua，JIN Xianzhong，HE Xianwu. Identification of Citrus tatter leaf in the south of Zhejiang province[J].Acta Phytopathologica Sinica，1992，22（3）：195-196.

[7] YOSHIKAWA N， SASAKI E，KATO M， TAKAHASHI T. The nucleotide sequence of apple stem grooving capillovirus genome[J].Virology，1992，191（1）：98-105.

[8] OHIRA K，NAMBA S，ROZANOV M，KUSUMI T， TSUCHIZAKI T. Complete sequence of an infectious fulllength cDNA clone of Citrus tatter leaf capillovirus：Comparative sequence analysis of capillovirus genomes[J]. Journal of General Virology，1995，76（Pt9）：2305-2309.

[9] SONG Z，LIU K H，LI Z A，ZHOU CY. RT-PCR-RFLP for genetic diversity analysis of the Citrus tatter leaf virus strain ofApple stem grooving virus[J]. European Journal of Plant Pathology，2016，144（3）：687-692.

[10]項(xiàng)周，程橋，謝宗周，王國平，洪霓.中國柑橘葉斑駁病毒和碎 葉病毒發(fā)生狀況及其分子特性研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2017，44 （1）：113-119. XIANG Zhou，CHENG Qiao，XIE Zongzhou，WANG Guoping， HONG Ni. Incidence and molecular characteristics of Citrus leaf blotch virus and Citrus tatter leaf virus infecting citrus in China[J].Acta Horticulturae Sinica，2017，44（1）：113-119.

[11]張金珠，鄒承武，黃俊源，鄧崇嶺，陳保善，張木清.廣西柑橘 碎葉病和葉斑病調(diào)查及其病原的遺傳多樣性分析[J].熱帶作 物學(xué)報(bào)，2021，42（5）：1414-1423. ZHANG Jinzhu，ZOU Chengwu，HUANG Junyuan，DENG Chongling，CHEN Baoshan，ZHANG Muqing. Investigation and the genetic diversity analysis of the pathogenic virus causing Citrus tatter leaf disease and Citrus leaf spot disease in Guangxi[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，2021，42（5）： 1414-1423.

[12] 高海馨，陳香玲，喬興華，廖慧紅，周常勇，周彥.蘋果莖溝病 毒柑橘碎葉株系的分布與序列分析[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2023， 50（5）：1318-1326. GAO Haixin，CHEN Xiangling，QIAO Xinghua，LIAO Huihong，ZHOU Changyong，ZHOU Yan. Distribution and molecular characterizationof Citrus tater leaf virus in China[J]. Journal of Plant Protection，2023，50（5）：1318-1326.

[13]宋震，劉科宏，楊方云，唐科志，李中安，周常勇.柑橘碎葉病毒 外殼蛋白基因的克隆和序列分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42 （10）：3741-3748. SONG Zhen，LIU Kehong，YANGFangyun，TANGKezhi，LI Zhongan，ZHOU Changyong. Cloning and sequence analysis of the CP gene of Citrus tatter leaf virus[J]. Scientia Agricultura Sinica，2009，42（10）：3741-3748.

[14]孫現(xiàn)超，周常勇，青玲，楊水英.柑橘碎葉病毒研究進(jìn)展[J].果 樹學(xué)報(bào)，2009，26（2）：213-216. SUN Xianchao， ZHOU Changyong，QING Ling，YANG Shuiying. Advances in research on Citrus tatter leaf virus[J]. Journal of Fruit Science，2009，26（2）：213-216.

[15]劉科宏，宋震，周彥，李中安，周常勇.8種柑橘類植物對柑橘 碎葉病毒分子組成的影響[J].果樹學(xué)報(bào)，2012，29（1）：90-93. LIU Kehong，SONG Zhen， ZHOU Yan，LI Zhongan， ZHOU Changyong. Influence of eight citrus cultivars on the compositionofCitrus tatter leaf virus[J].Journal ofFruit Science，2012， 29（1）：90-93.

[16]張?zhí)祉?柑橘病毒病[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000. ZHANG Tianmiao.Virus disease of citrus[M].Beijing：China Agriculture Press，2000.

[17]唐科志，周常勇，王雪峰，周彥，劉科宏，劉英.利用RT-PCR檢 測柑橘碎葉病毒的研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2005，35（增刊1）： 118-119. TANG Kezhi， ZHOU Changyong，WANG Xuefeng，ZHOU Yan，LIU Kehong，LIU Ying.Detection of Citrus tatter leaf virus （CTLV） byRT-PCR[J].ActaPhytopathologica Sinica，2005，35 （Suppl. 1）：118-119.

[18] 劉科宏，周常勇，宋震，周彥，李中安，唐科志.運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 技術(shù)檢測柑橘碎葉病毒[J].果樹學(xué)報(bào)，2009，26（5）： 748-751. LIU Kehong，ZHOU Changyong，SONG Zhen，ZHOU Yan，LI Zhongan，TANG Kezhi.Detection of Citrus tatter leaf virus （CTLV） by real-timeRT-PCR[J].Journal ofFruit Science，2009， 26（5）：748-751.

[19]宋震，周常勇，劉科宏，李中安.柑橘碎葉病毒巢式RT-PCR 檢 測方法建立及應(yīng)用[J].果樹學(xué)報(bào)，2011，28（3）：458-462. SONG Zhen，ZHOU Changyong，LIU Kehong，LI Zhongan. Establishment of nested RT-PCR for detecting Citrus tater leaf virus[J]. Journal ofFruit Science，2011，28（3）：458-462.

[20]MOYA A，HOLMES E C，GONZALEZ-CANDELAS F. The population geneticsand evolutionary epidemiology of RNA viruses[J]. Nature Reviews Microbiology，2004，2（4）：279-288.

[21]HOLMES E C.The evolutionary genetics of emerging viruses[J]. Annual Review of Ecology，Evolution，and Systematics，2009，