Mechanism of Action of PLIN5 in Improving Ventricular Function in Pulmonary Arterial Hypertension by Regulating Fatty Acid Metabolism

Danzengdunzhu1，GAO Han1，QIN Shanshan1，XIONG Shiqiang2，YANG Jiali ，HEJian2，YUE Tian ，HOU Jun2 （1.MedicalColege，Tibet University，Lhasa 85000，Tibet，China；2.Department of Cardiology，The ThirdPeople’ s Hospital of Chengdu，Chengdu 610031，Sichuan，China）

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheoleandpotentialinfluenceofperilipin5（PLI5）intheabormalitisoflipidmetabolism inhypoxicpulmonaryhypertensionrats.MethodsTheratmodelsof hypoxicpulmonaryhypertensionwereconstructedbymeansofa hypobaricoxygenchamberandrightventriclarstructureandfunctionandhaemodynamicindexesreasessedinoal/Pkockout miceinanormal/hypoxicenvironmentforevaluatingrightventricularfunction.TheefectsofhypoxiaandPLN5onfatyacidmetabolism wereaessedbysystemiclipidmetabolismcumulationandchangesinlocalfattcidmetabolitelevelsinteartTeectsofyoia andPLIN5ontheexpresionandactivityofkeyenzyesinfattacidmetabolismweresubsequentlyevaluatedtoexploreteotential influenceofPIN5onfattacidmetabolism.Byevaluatingthestructureandfunctionofcardiomyocytemitochondria，weexploredthe protectivefectofI5onmitochondriathoughtheregulationofattyacidmetabolism.ResultsHypoxicpulmonaryhypertesionwas asociatedwithsructuralhangsndfuntioaldifteightveticleichereaggavatedy5eficiecytat acidmetabolisitsderoaloditiosutispathonic.Inatsioicpuoaryhertesiosigcatly fattacidetabasdencdbyeoagfttcidsisdteitatiooffatycidodatiogatcid synthesisndoxidationbymodulatingthactivitiesoffatyacidsynthaseandhormone-sensitivelipase.Meanwhile，LI5canprotect cardiomyocytemitochondriafrommitochondrialdamagecausedbyabnormalfattyacidmetaboismbyregulatingfattacidmetabolis.

ConclusionPLIN5protectshypoxicpulmonaryhypertensioncardiomyocytesfrommitochonrialdamageinducedbyabnomalfatyacid metabolism by regulating fatty acid metabolism of fatty acid synthesis and oxidation.

【Keywords】 Hypoxic pulmonary hypertension；Perilipin 5；Fatty acid metabolism； Mitochondrion

低氧肺動脈高壓（hypoxic pulmonaryhypertension，HPH）是長期低氧狀態(tài)導致的肺動脈壓力升高的疾病，HPH高死亡率極大程度上加重了社會和家庭的醫(yī)療負擔[1-3] 。

1脂滴包被蛋白5與HPH的關系

缺氧造成HPH心肌組織脂肪酸和未完全氧化的脂肪酸代謝產(chǎn)物積累[4-5]，并調節(jié)細胞凋亡，激活核因子 κB 及相關的炎癥通路，加重肺血管的重構進而加重肺動脈高壓[6-7]。脂肪酸的儲存和動員受到諸多酶的調控[8-9]。此外，線粒體功能也會受到脂肪酸代謝異常的影響[10-11]。過量脂肪酸積累導致線粒體電子傳遞鏈受損、線粒體膜電位下降以及氧化應激增加[12-13]。線粒體功能異常導致血管內皮細胞的損傷并促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移，導致血管重構[14-16]。脂滴包被蛋白5（perilipin 5，PLIN5）在脂肪酸代謝、細胞能量代謝、細胞增殖、血管重構以及炎癥反應與氧化應激等方面扮演著重要的角色。PLIN5是脂肪的儲存與動員過程中重要的調控因子，通過促進脂滴形成，防止過多的脂肪酸在細胞內積累并降低脂毒性[17-18]。同時，PLIN5可以通過影響線粒體功能，調節(jié)脂肪內脂肪酸氧化，并幫助細胞適應低氧環(huán)境，維持能量代謝的平衡。此外，PLIN5能夠保護線粒體功能，降低低氧環(huán)境下的氧化應激[19-21]

基于上述研究基礎，PLIN5存在通過調控脂肪酸代謝、保護線粒體從而保護HPH免受脂肪酸代謝異常的影響的可能，PLIN5在HPH研究中具有重要的價值。然而，目前關于PLIN5對HPH影響效果的研究幾乎空白。因此，本研究通過評估PLIN5缺失對HPH大鼠的右心室功能、脂肪酸代謝水平變化、脂肪酸代謝關鍵酶變化以及評估PLIN5缺失對HPH大鼠線粒體功能的影響，表明PLIN5對HPH大鼠心肌具有保護作用。

2方法與材料

2.1動物飼養(yǎng)與模型建立

動物實驗經(jīng)成都達碩實驗動物有限公司實驗動物倫理委員會批準（D-2305-06）。16只6周齡的健康成年雄性SD大鼠（賽業(yè)生物），體重 （223±12）g ，隨機分為2組，分別為對照組（CTRL組）以及HPH組。16只PLIN5大鼠（賽業(yè)生物），體重（ ，隨機分為2組，分別為PLIN5組以及HPH-PLIN5組。其中CTRL組及 組正常飼養(yǎng)，HPH組及HPH-PLIN5組置于密封低壓低氧艙飼養(yǎng)，實驗周期 0

2.2 血流動力學監(jiān)測

超聲心動圖檢測：檢測前一天將待檢測大鼠胸部毛發(fā)脫去備用。檢測前半小時對大鼠進行麻醉（異戊巴比妥的生理鹽水溶液， ），并在檢測過程中給予持續(xù)的異戊巴比妥麻醉。將大鼠放置在操作臺上，取仰臥位并固定四肢，涂抹超聲耦合劑并檢測記錄縱向軸平面、短軸平面以及血流動力學指標（MX250，VisualsonicVEVO）。每一指標均連續(xù)測量3個心動周期取平均值。右心導管檢查測定肺動脈壓：經(jīng)麻醉的大鼠，暴露頸外靜脈，結扎遠心端后，導管自切口緩慢推人肺動脈，用含肝素的生理鹽水溶液充滿帶換能器的導管，排出氣泡后連接換能器至生理記錄儀并記錄肺動脈壓力隨時間變化曲線。超聲心動圖及右心導管檢查結果評估HPH動物模型建立成功［正常大鼠肺動脈壓力為15＼～25mmHg（ ]。

2.3 油紅0染色

心臟切片（ 10μm 室溫下使用 10% 福爾馬林的磷酸鹽緩沖液固定 20min 。 60% 異丙醇洗滌3次，新鮮制備的 0.5% 油紅O溶液處理 20min 。 60% 異丙醇沖洗3次后熒光顯微鏡（奧林巴斯CX23）成像[22] O

2.4血液脂肪酸指標分析

取1、7、14、21、28d各組大鼠全血，送檢血脂指標：總膽固醇（totalcholesterol，TC）、甘油三酯（triacylglycerol，TG）、低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein，LDL）以及高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，HDL）水平。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附分析

稱取組織樣本并根據(jù)重量添加裂解緩沖液（武漢碧云天，P0013B）勻漿。 旋轉混合勻漿，離心去除細胞碎片 （ ，二喹啉甲酸試劑盒（碧云天）對蛋白定量后參考酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）試劑盒說明書進行定量檢測。

2.6 蛋白質印跡法

解剖取大鼠心臟，裂解緩沖液提取蛋白后使用二喹啉甲酸試劑盒定量蛋白。對細胞蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在封閉緩沖液中室溫孵育 。將膜與一抗在 下孵育過夜，然后將膜在辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗中室溫孵育 。通過增強化學發(fā)光使免疫反應條帶可視化。使用ImageJ1.54軟件進行灰度值分析并進行統(tǒng)計分析。

2.7透射電子顯微鏡

取 28d 大鼠心臟組織，經(jīng)脫水、滲透、包埋聚合后固化，將樹脂固化樣本切片后置于透射電子顯微鏡（transmissionelectron microscope，TEM）上，經(jīng)醋酸鈾（ 1%） 及檸檬酸鉛 （0.5%） ）染色后TEM（JEOLJEM-F200）采集圖像。

2.8 統(tǒng)計分析

使用SPSS26.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)表示為均數(shù) ± 標準差 ，通過不成對的樣本 檢驗確定兩個個體組之間的統(tǒng)計學顯著性。采用方差分析法對多組大鼠進行統(tǒng)計學意義分析。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù) 描述，采用Kruskal-WallisH 檢驗進行多組間比較。 Plt;0.05 被認為具有統(tǒng)計學差異。

3結果

3.1PLIN5缺失影響HPH大鼠右心室功能和形態(tài)

超聲結果表明（圖1A、1B和1D），CTRL組與PLIN5組的右心室大小及右心室壁厚度無明顯的統(tǒng)計學差異，表明PLIN5對正常環(huán)境下的大鼠右心室功能無影響。處于低氧環(huán)境下的HPH組右心室大小和右心室壁厚度均有明顯的增加，與CTRL組相比有統(tǒng)計學差異（ Plt;0.05 ）。而HPH-PLIN5組右心室大小及右心室壁厚度與CTRL組相比有明顯的統(tǒng)計學差異（Plt;0.01） 。

評估大鼠右心室射血分數(shù)（rightventricularejectionfraction，RVEF）、右心室流出道（rightventricularoutflowtract，RVOT）峰值流速、RVOT速度-時間積分（velocity-timeintegral，VTI）、收縮期肺動脈壓（systolicpulmonaryarterypressure，sPAP）、舒張期肺動脈壓（diastolicpulmonaryarterypressure，dPAP）以及平均肺動脈壓（mean pulmonaryarterypressure，mPAP）。結果表明正常環(huán)境下，PLIN5對大鼠右心室射血功能（RVEF、RVOT峰值流速、RVOTVTI、sPAP、dPAP、mPAP）無明顯影響，HPH-PLIN5組與HPH組相比具有統(tǒng)計學差異（ Plt; 0.05），表明PLIN5的缺失加重了肺動脈高壓（圖1C，表1）。心導管檢查結果同樣表明，HPH組出現(xiàn)顯著的肺動脈壓升高，與CTRL組有明顯的統(tǒng)計學差異（ Plt;0.01） ，表明HPH模型建立成功。根據(jù)超聲心動圖及心導管檢查的結果，HPH-PLIN5組與HPH組相比具有統(tǒng)計學差異（ Plt;0.05 ），表明PLIN5的缺失加重了肺動脈高壓（圖1E，表2）。

注：A為大鼠心臟超聲圖；B為右心室內徑統(tǒng)計；C為RVEF統(tǒng)計；D為右心室壁厚度統(tǒng)計；E為各組大鼠頸靜脈插管肺動脈壓力波形圖。 n s 表示無統(tǒng)計學差異， 表示 Plt;0.05 表示 表示 。

3.2PLIN5缺失影響HPH大鼠心肌細胞脂肪酸代謝

3.2.1PLIN5對HPH大鼠血清及右心室脂肪酸代謝標志物的影響

油紅0染色結果表明（圖2A和2B），低氧環(huán)境下的HPH組及HPH-PLIN5組均出現(xiàn)組織脂肪的積累，油紅O染色結果中，紅色信號均與CTRL組有統(tǒng)計學差異（ ？lt;0.05 ）。評估右心室組織中乙酰輔酶A水平，1d及28dELISA結果表明（圖2C＼～E），相比CTRL組， 組以及HPH組的乙酰輔酶A水平明顯下降，提示脂肪酸合成受阻，HPH-PLIN5組與CTRL組出現(xiàn)顯著的差異（Plt;0.0001。PLIN5組與CTRL組的游離脂肪酸和乳酸均無統(tǒng)計學差異，而HPH組和HPH-PLIN5組均與CTRL組相比有顯著的統(tǒng)計學差異（ ，提示在低氧環(huán)境下，脂肪酸氧化代謝受阻，且無氧代謝更加活躍，造成脂肪酸代謝降低，代謝產(chǎn)物累積。對比HPH組與HPH-PLIN5組可以發(fā)現(xiàn)， 在調控脂肪酸代謝過程中起重要的作用，PLIN5的缺失使游離脂肪酸積累更嚴重同時進一步增加了心肌組織的無氧代謝。

注：A為大鼠心臟切片油紅O染色；B為油紅O染色紅色信號統(tǒng)計；C為ELISA檢測乙酰輔酶A表達水平；D為ELISA檢測乳酸表達水平；E為ELISA檢測游離脂肪酸表達水平；F為大鼠血清TC水平；G為大鼠血清TG水平；H為大鼠血清LDL水平；I為大鼠血清HDL水平。 n s 表示無統(tǒng)計學差異，*表示 Plt;0.05 ， 表示 ，****表示

通過評價1＼～4周血清脂肪酸代謝相關指標，包括TC、TG、LDL以及HDL在血清中的積累量，結果表明（圖2F＼～I），低氧環(huán)境下的大鼠血清中TC、TG、LDL均明顯上升，表明HPH病程中，存在脂肪酸的代謝異常，PLIN5組及HPH-PLIN5組的結果受到環(huán)境的影響，在PLIN5組中，TC、TG、LDL均緩慢上升，而HDL出現(xiàn)明顯的降低，表明PLIN5的缺失對正常環(huán)境下的大鼠脂肪酸代謝有影響。相比之下，HPH-PLIN5組中，TC、TG、LDL均顯著上升。結果表明，PLIN5對正常及低氧環(huán)境下的大鼠體內脂肪酸代謝水平均有影響，而在HPH模型中，PLIN5對脂肪酸代謝影響更為顯著，相比HPH組有明顯的差異（ Plt;0.05） ，也表明PLIN5對HPH的脂肪酸代謝異常具有保護作用，PLIN5的缺失會使HPH的脂肪酸代謝異常進一步惡化。

3.2.2PLIN5對脂肪酸代謝關鍵酶活性水平的影響 激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL），是脂肪分解的限速酶。本研究對不同組的HSL表達進行分析，蛋白質印跡法（Westernblotting，WB）結果及統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明（圖3A和3B），正常環(huán)境下PLIN5的缺失影響了HSL的表達，與正常組有統(tǒng)計學差異（ Plt; 0.05），低氧環(huán)境下HPH、HPH-PLIN5組中，HSL的表達均有明顯的下降 。HSL作為脂肪酸分解的關鍵限速酶，HSL水平的變化反映了脂肪酸分解過程受到影響。PLIN5蛋白的缺失導致脂肪酸分解受限，PLIN5對HPH大鼠的脂肪酸分解影響更為顯著。同時也評估了脂肪酸合成酶（fattyacidsynthetase，F(xiàn)AS）的分泌活性。WB結果及數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明（圖3C和3D），低氧環(huán)境下的HPH組與HPH-PLIN5組均無明顯的FAS表達降低，表明HPH大鼠的脂肪酸合成并未受限，而低氧環(huán)境下PLIN5蛋白表達降低會導致HPH大鼠的脂肪酸合成效率顯著降低（ Plt;0.001 。

3.3PLIN5對HPH大鼠線粒體結構與功能的影響

線粒體作為細胞能量代謝中樞，在HPH中起著至關重要的作用。HPH患者長期處于低氧環(huán)境下，線粒體電子傳遞鏈功能異常、能量代謝異常。本研究通過TEM觀察了不同環(huán)境下飼養(yǎng)28d大鼠的線粒體形態(tài)，并評價了線粒體電子傳遞鏈細胞色素C氧化酶亞基1（cytochromeCoxidasesubunit1，COX1）NADH脫氫酶1（NADHdehydrogenase1，ND1）的表達，也評估了不同組大鼠的ATP水平。結果表明，正常環(huán)境下飼養(yǎng)的2組大鼠心肌細胞線粒體均無明顯的差異，線粒體呈規(guī)則球體或橢球體，雙層膜結構，線粒體內嵴分布均勻，而HPH組及HPH-PLIN5組的心肌細胞線粒體均出現(xiàn)明顯的變形，HPH-PLIN5組的心肌細胞線粒體則出現(xiàn)明顯的大小不均一、內外膜界限不明顯以及內嵴消失，提示線粒體結構出現(xiàn)損傷（圖4A）。此外，與CTRL組相比，HPH組及HPH-PLIN5組的COX1及ND1均出現(xiàn)表達下調，其中HPH組的COX1蛋白相對表達量及ND1蛋白相對表達量均與CTRL組有統(tǒng)計學差異（ Plt;0.05） ，HPH-PLIN5組的COX1及ND1表達量與CTRL組相比有顯著差異（ Plt;0.01 ，圖4B和4C）。為總體評價線粒體能量代謝水平，本研究對不同組心臟組織ATP水平進行了評估，結果表明（圖4D），PLIN5在正常環(huán)境下對線粒體的能量代謝無明顯影響，ATP的表達水平與CTRL組相比無明顯統(tǒng)計學差異，HPH及HPH-PLIN5組均出現(xiàn)明顯的ATP水平下降，與CTRL組相比有明顯的統(tǒng)計學差異（ Plt; 0.01）。

注：A為大鼠線粒體結構TEM形貌圖；B為ELISA檢測大鼠線粒體COX1表達量；C為ELISA檢測大鼠線粒體ND1表達量；D為ELISA檢測大鼠心臟ATP水平。 n s 表示無統(tǒng)計學差異， 表示 Plt;0.05 表示 Plt;0，01 。

4分析及結論

慢性阻塞性肺疾病患者中有 10%～30% 可能會發(fā)展為HPH，造成極大的醫(yī)療及經(jīng)濟負擔[23]。脂肪酸代謝是HPH病程中關鍵因素之一，并受脂肪酸的儲存和動員調控。PLIN5作為脂肪酸儲存和動員的關鍵調控蛋白，在脂肪酸代謝中起關鍵作用。本研究結果顯示，HPH患者局部及血液循環(huán)中存在明顯的脂肪酸及未完全代謝脂肪酸產(chǎn)物增加，PLIN5缺失明顯加重了脂肪酸的累積，并導致大鼠右心室擴張、右心室肥厚、血流動力學改變。

PLIN5參與心肌細胞的脂肪酸代謝，并調控血清代謝物水平[24]。本研究表明，PLIN5 通過調控 HSL、FAS等脂肪酸代謝關鍵限速酶，并保護脂肪酸代謝過程。線粒體作為細胞能量代謝中樞，在HPH中起著至關重要的作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，PLIN5能夠維持大鼠心肌細胞線粒體正常形態(tài)。對COX1及ND1活性進行評估表明，PLIN5能夠調控線粒體電子傳遞鏈關鍵酶活性，保護線粒體電子傳遞鏈功能并提高HPH大鼠心肌線粒體產(chǎn)生ATP活性。

綜上所述，PLIN5能夠通過多方面作用保護HPH大鼠免受脂肪酸代謝異常的影響。首先，PLIN5能夠通過調控脂肪酸合成及動員關鍵酶維持脂肪酸代謝的正常功能。其次，PLIN5能夠保護線粒體形態(tài)并維持線粒體功能，提升線粒體產(chǎn)能效率。最后，PLIN5能夠改善HPH的右心室擴張、右心室肥厚并改善HPH大鼠血流動力學。

然而，本研究雖證明了PLIN5對HPH有保護作用，但仍有部分內容需要進一步研究。如PLIN5調控HPH脂肪酸代謝的具體機制及相關通路仍未探明，需要更全面地研究PLIN5在HPH中的作用。本研究結果及后續(xù)深入研究將會為HPH的治療提供新的思路和研究方向。

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