Nicotinamide Mononucleotide Inhibits Ferroptosis in Acute Myocardial Infarction by Enhancing Mitophagy

LI Yajia，LIU Dishiwen，ZHAO Xin，HAN Xueyu， WANG Xuewen，CAO Zhen，FU Yuntao，ZHAO Qingyan （ Institute Cardiology， 430060China）

【Abstract】ObjectiveToinvestigatewhethernicotinamidemononucleotide（NMN）caninhibitferoptosis incardiomyocytesand improveiflammatoryresponseandcardiacfunctionafteracutemyocardialinfarction（AMI）bymodulatingmitophagy.MethodsInthis prospective controlled study，3Oadult male SDrats wererandomized into3 groups：the Sham group，the AMgroup，andthe AMI + NMN group ， with10rats inchgoup.Echocardiogaphyassedtoetectleftventricularnd-dastolcvolue（LVEDV），leftventriculard-stolic volume（LVESV），trlarractiosong（LVS），ndleftentriulaeetiraction（LVE）inelftentricefatsin eachgroup；HEstainingasusedtoessthlveltheiflamatoryresposeteftventricle；aonstaingsusedtodetecthe degrefibrosisteleftventcle；Prusianbluesaingasdtoetetisseionoeposiiorasmissolectroot detecteoalue；oeeprsessded （FTMT），glutateperoxidase4（GPX4）andsoutecaerfmily7member11（S711）aswellasihodrialutoelate indexesPTEN-inducedinase1（PK1）microtubule-asocatedprotein1lightchin3（3）-IandLC3-I，andsilenceifoatio regulator1（SIRT1）.ResultsComparedwiththe Samgroup，theLVEDVandLVESVintheAMI groupweresignificantlyhigher（ Plt; 0.05），and the LVFS and LVEF were significantly lower （ Plt;0.05 ）；the level inflammation，the degree fibrosis，and the iron deposition intheleftvtarsseeisdddalmagatedtexpivelsf4， SLC7A11，and SIRT1 were significantly lower （ Plt;0. 05 ），and the PINK1 protein expression level and the ratio the LC3-II to LC3- I protein expression level increased （ P lt;0.05）. Compared with the AMI group，the LVEF the AMI + NMN group was increased （ ： theinflammatiollgreoosisdeposlrulaseduddgefl damage was reduced；the expresson levels the FTMT，GPX4，SLC7A11，and SIRT1 proteins were increased （ Plt;0.05 ），and the levels the PINK1 protein expresson and the ratio the LC3-I to LC3-I protein expression levels were increased （ Plt;0.05）. Conclusion After acutemyocadalifiatselfiocaalssssaedStilloudtte extremeenvironmenthyoxia，andtheferoptosiscardiomyocytesasincreased.SuplementationMouldupregulateS1 expreiondecioegdoridlteotosisfo improving the inflammatory response and cardiac function after acute myocardial infarction in rats.

【words】Acutemyocardialinfarction；Nicotinamidemoonucleotide；icotinamideadeninedinucleotide；Mitophagy；otosis

急性心肌梗死（acutemyocardialinfarction，AMI）發(fā)生于冠狀動脈急性阻塞的情況下，導致心肌組織缺乏充足的血液供應，由此引發(fā)心肌細胞缺血或梗死[1]。盡管心肌梗死（myocardial infarction，MI）后可采用再灌注治療來修復病變血管，但由于全球各地醫(yī)療條件的不同和技術水平的差異，并非所有AMI患者都能夠獲得及時有效的治療。鑒于心肌細胞的不可再生特性，對幸存的心肌細胞進行及時有效的挽救顯得尤為關鍵，有助于減小梗死面積，并最大程度地保護心臟的泵血功能。

目前的研究表明，MI后心肌細胞主要通過壞死、凋亡、壞死性凋亡和細胞焦亡等方式發(fā)生死亡，這些死亡方式并非獨立存在，往往混雜在一起，它們是造成MI后心肌損傷的主要因素。隨著對鐵死亡的深入研究，發(fā)現鐵死亡是MI后心肌細胞發(fā)生的重要細胞死亡方式之一[2]。研究[3]發(fā)現，鐵死亡相關基因的差異性表達對MI患者具有顯著的診斷意義。通過對MI小鼠模型進行定量蛋白質組學分析發(fā)現，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathioneperoxidase 4，GPX4）的下調促進了MI時心肌細胞的鐵死亡[4]。Song等[5]發(fā)現來源于人臍帶血間充質干細胞的外泌體可通過抑制鐵死亡減輕AMI小鼠的心肌損傷。鐵死亡是一種鐵離子依賴性的脂質過氧化程序性細胞死亡方式[6]。鐵死亡細胞的形態(tài)特征主要體現在線粒體的變化上，包括線粒體膜密度的增加、線粒體收縮、嵴的損傷以及外膜的破裂等[7]。線粒體是細胞能量代謝的中心，當線粒體膜的破壞達到一定程度時，細胞將不可逆地死亡[8]。線粒體自噬能夠清除功能失調或多余的線粒體，減少細胞內活性氧釋放，從而發(fā)揮保護作用，因此及時清除受損的線粒體對于維持細胞穩(wěn)態(tài)和活力至關重要[9]。線粒體自噬過強或過弱都會對細胞造成不利影響[10]

煙酰胺單核苷酸（nicotinamidemononucleotide，NMN）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide，NAD）的前體物質。NAD影響許多細胞過程，包括能量代謝、DNA修復和免疫調節(jié)等[1]。此外，NMN可改善線粒體自噬[12]，恢復和改善線粒體功能[13]。生物體內NAD水平升高會激活沉默信息調節(jié)因子1（silenceinformationregulator1，SIRT1），改善線粒體氧化代謝水平，調節(jié)線粒體功能和自噬[14]。APP/PS1小鼠是一種常用于阿爾茨海默病研究的轉基因小鼠模型，研究發(fā)現運動或口服NMN可改善APP/PS1小鼠的線粒體自噬功能，減輕阿爾茨海默病的病理變化并改善認知功能[15]NMN的長期治療已被證明可通過增強顆粒細胞的線粒體自噬水平改善年齡相關的卵巢儲備減少[16]Yagi等[17]發(fā)現NMN給藥減少了p32cKO小鼠的溶酶體損傷，改善了線粒體的自噬功能和鐵死亡，緩解了p32cKO小鼠的心臟功能障礙。在AMI中，NMN是否可通過調節(jié)線粒體自噬抑制心肌細胞的鐵死亡仍不清楚。因此，本研究建立AMI大鼠模型，用NMN進行干預，探究NMN是否可通過調節(jié)線粒體自噬抑制心肌細胞的鐵死亡，改善AMI后的炎癥反應和心臟功能。

1材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性SD大鼠購于三峽大學［許可證號：SYXK（鄂）2022-0061]，體重 210～250g ，適應性飼養(yǎng)1周后開始做實驗。本研究遵從《美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物研究指南》，并通過武漢大學人民醫(yī)院實驗動物福利倫理審查委員會審批［WDRM動（福）第20191211號]。將30只成年雄性SD大鼠隨機分為3組：對照組（Sham組）、AMI組和 AMI+NMN 組，每組10只。使用新鮮配制的 2% 戊巴比妥鈉（劑量 50mg/ kg ）腹腔注射麻醉SD大鼠，通過結扎SD大鼠冠狀動脈前降支構建AMI模型[18]。Sham組只穿線不結扎，AMI組和 AMI+NMN 組通過結扎SD大鼠冠狀動脈前降支構建AMI模型。 AMI+NMN 組在AMI模型建立成功，麻醉蘇醒后立即注射NMN（ 400mg·g-1： ，持續(xù)腹腔注射兩周）干預治療，另外兩組每天腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)注射兩周后進行下一步檢測。

1.2 超聲心動圖檢查

SD大鼠飼養(yǎng)兩周后進行經胸超聲心動圖檢查。

將大鼠放入連接異氟醚氣體的透明箱中進行麻醉，然后使用超聲成像系統(tǒng)（VINNO6VET）進行超聲心動圖檢查。將探頭置于胸骨旁左心室長軸切面，通過M型超聲心動圖檢查左心室長軸橫截面的心臟功能，測量SD大鼠的左室舒張末容積（leftventricularend-diastolicvolume，LVEDV）、左室收縮末容積（leftventricularend-systolicvolume，LVESV）左室射血分數（leftventricularejectionfraction，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）等參數，其測量結果取3個心動周期的平均測量值。

1.3心肌組織病理學檢測

將大鼠麻醉完成后固定于手術臺開胸，迅速剪取分離心臟，將整個心臟置于 4% 多聚甲醛固定，經二甲苯及乙醇梯度脫水后石蠟包埋，取 $5～{＼upmu＼mathrm{m}}$ 厚組織切片。對于HE染色，切片用蘇木精染色 10min ，然后用苯胺藍染色 5min ，最后用 1% 乙酸溶液染色 2min 。對于Masson染色，切片在蘇木精染液中浸泡過夜后，把切片浸于蘇木精染液中 加熱 30min ，自來水洗 30s 后，在麗春紅酸性復紅液中浸染 1min ，流水稍洗，于1% 鹽酸乙醇中分化 1min 。稍洗后于冰醋酸水溶液中浸染 6min 。稍洗后于 1% 磷鉬酸水溶液中浸染約1min 后，稍微瀝干后浸于苯胺藍液中浸染 8～15s 0最后分別用 1% 冰醋酸漂洗分化、無水乙醇脫水和二甲苯透明后封片。對于普魯士藍染色，將等體積的亞鐵氰化鉀溶液和鹽酸混合，制成有效的鐵染色溶液。然后將切片置于工作溶液孵育 3min 。

1.4 透射電鏡

取約 大鼠左心室心肌組織，置于預冷的電鏡固定液（賽維爾，中國武漢）中 ，磷酸鹽緩沖鹽水漂洗后將組織塊置于 1% 俄酸中，室溫避光條件下固定 。固定完成后依次使用乙醇、丙酮脫水，將組織塊包埋于環(huán)氧樹脂中，放于烤箱聚合 。樹脂塊于超薄切片機進行切片，枸橡酸鉛溶液染色。干燥后在透射電鏡（HITACHI，HT7800）下觀察線粒體形態(tài)和心肌細胞間閏盤的結構。

1.5 蛋白質印跡法

取大鼠左心室組織，加入RIPA裂解液后研磨成組織勻漿， 離心后，取上清液，使用BCA蛋白檢測試劑盒（碧云天，中國）定量。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉至聚偏二氟乙烯膜，封閉后分別加入 β -actin（三鷹，中國， ）、線粒體鐵蛋白（mitochondrialferritin，FTMT）（Genetex，美國，1：1000）GPX4（Abcam，英國， ）、溶質載體家族7成員11（solute carrier family7member11，SLC7A11）（三鷹，中國， ）、PTEN誘導激酶1（PTENinducedkinase1，PINK1）（GeneTex，美國， ）、微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1lightchain3，LC3）（MBL，日本， ）和SIRT1（ABclonal，中國， ）， 孵育過夜。二抗孵育后顯色，使用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值[20]

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以 表示，多組間比較采用Bonferroni校正后的單因素方差分析進行統(tǒng)計分析，對非正態(tài)分布的數據，使用Kruskal-Wallis非參數檢驗比較多組間差異， Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組大鼠超聲心動圖檢查結果比較

干預兩周后，超聲心動圖檢查結果顯示（圖1），與Sham組相比，AMI組LVEDV 顯著增加（ Plt;0. 05. ），LVESV顯著增加（ Plt;0. 05 ），LVEF顯著降低（ Plt; 0.05），LVFS顯著降低（ Plt;0. 05. ）；和AMI組比較，AMI+NMN 組LVEF增加（ Plt;0.05 ），LVFS、LVEDV和LVESV則無明顯差異（ Pgt;0.05 （表1）。

2.2各組大鼠心肌組織形態(tài)變化

HE染色結果顯示，Sham組大鼠心肌組織結構完整，心肌細胞形態(tài)規(guī)則，細胞排列緊密整齊，未見形態(tài)結構改變；AMI組大鼠心肌細胞排列紊亂，可見炎癥細胞浸潤（圖2黑色箭頭所示）； AMI+NMN 組大鼠心肌組織結構較AMI組完整，細胞損傷及炎癥細胞浸潤明顯減輕。Masson染色結果顯示，AMI組大鼠心肌組織出現較多藍色膠原纖維沉積（圖2黑色箭頭所示），AMI+NMN 組藍色膠原纖維較AMI組減少。普魯士藍染色結果顯示，Sham組大鼠心肌組織幾乎無鐵離子沉積，而AMI組較 AMI+NMN 組普魯士藍陽性細胞明顯增多（圖2黑色箭頭所示）。

2.3心肌組織線粒體結構和心肌細胞間閨盤結構的比較

透射電鏡掃描結果表明，Sham組心肌組織線粒體排列清楚，結構完整，線粒體嵴清晰可見；而AMI組心肌組織中的線粒體變圓縮小，線粒體嵴斷裂、減少甚至消失，可觀察到線粒體自噬體的存在； AMI+NMN 組線粒體損傷較AMI組減輕，但仍有線粒體嵴斷裂，與

AMI組相比，線粒體自噬體增多（圖3）。透射電鏡掃描結果顯示，Sham組心肌細胞間閨盤與心肌纖維長軸垂直，結構完整，排列整齊；AMI組部分心肌細胞間的閏盤結構遭到破壞，排列雜亂；與AMI組相比， AMI+ NMN組心肌細胞間閏盤結構完整性較好，并且在透射電鏡掃描的低倍鏡視野中可看到較多的線粒體自噬體（圖4）。

注：黑色箭頭代表閏盤結構被破壞。

2.4各組大鼠心肌組織鐵死亡和線粒體自噬相關蛋白的表達水平

與Sham組相比，AMI組的FTMT、GPX4、SLC7A11和SIRT1蛋白表達水平顯著下降（ Plt;0.05 ；與AMI組相比， AMI+NMN 組FTMT、GPX4、SLC7A11和SIRT1表達水平上升（ Plt;0.05） 。與Sham組相比，AMI組大鼠的PINK1表達和LC3-II與LC3-I表達的比值顯著上升（ ？ Plt;0.05） 。與AMI組相比， AMI+NMN 組大鼠的PINK1表達和LC3- I 與LC3-I表達的比值上升（ Plt; 0.05）（圖5）。

3討論

已有很多研究證明NAD可減輕MI后心肌組織損傷，減輕MI后的炎癥和纖維化。Tannous等[2i]研究發(fā)現，補充NAD可改善線粒體復合物I和IV以及檸檬酸合酶的活性，通過降低心肌組織中聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase，PARP1）的水平來減輕MI后的炎癥和纖維化。靜脈注射NAD可減輕缺血再灌注大鼠心肌細胞的凋亡損傷[22]。本團隊的實驗結果也顯示，與對照組大鼠相比，AMI大鼠心肌組織的炎癥細胞浸潤增加，纖維化程度加重。NMN干預則可減輕心肌組織的炎癥反應和纖維化程度，改善AMI后心臟的結構重構。

自噬在處理受損或衰老的細胞器（如線粒體）中起著關鍵作用。線粒體是細胞活性氧的主要來源，線粒體自噬能力過弱可能使受損的線粒體殘留，造成細胞氧化應激損傷甚至鐵死亡。研究[23]發(fā)現， 小鼠和 小鼠在MI損傷后，線粒體自噬受到抑制，MI面積增大，心臟損傷加重。AMI期間，心肌細胞處于缺血缺氧狀態(tài)，經歷能量損失，自噬途徑可通過維持基礎代謝需求起到保護作用。在缺血性心臟中，AMP活化的蛋白質激酶激活，心肌細胞自噬增強，以清除功能障礙的線粒體[10]。已經有研究證明，NMN可改善線粒體自噬，恢復和改善線粒體功能。NAD水平升高會激活SIRT1，研究表明SIRT1可改善線粒體氧化代謝水平，調節(jié)線粒體功能和自噬。補充NAD可激活SIRT1，刺激自噬體形成并增強基礎自噬水平，而SIRT1的缺乏則會抑制自噬水平[9]。本團隊的研究表明，與對照組相比，AMI大鼠心肌組織的線粒體自噬水平增強，并且NMN干預可上調AMI大鼠SIRT1蛋白的表達，增強AMI大鼠的線粒體自噬水平。

鐵死亡是AMI患者心肌細胞發(fā)生死亡的重要形式之一，與AMI后心臟功能的惡化密切相關[24]。線粒體自噬是一種特殊的自噬形式，鐵死亡與線粒體自噬密切相關，但線粒體自噬的強度與鐵死亡的關系仍存在爭議。Yang等[25]研究發(fā)現，新型線粒體靶向性硫化氫供體AP39通過靶向PINK1/Parkin信號通路抑制線粒體自噬和心肌細胞鐵死亡，從而改善MI大鼠的心肌纖維化。Li等[26]發(fā)現，線粒體定位蛋白含CDGSH鐵硫結構域蛋白3（CDGSHiron-sulfurdomain-containingprotein3，CISD3）敲低可顯著加速脂質過氧化，引起細胞內鐵積累，促進細胞鐵死亡。激活線粒體自噬可通過清除受損的線粒體減輕CISD3敲低誘導的鐵死亡。Yagi等[1]研究發(fā)現，補充NAD前體NMN可改善小鼠的心臟功能并延長壽命，恢復線粒體的自噬功能，改善線粒體功能障礙導致的鐵死亡。有研究[1]表明，補充NMN可提高32cKO小鼠體內NAD水平，增強溶酶體的酸化和功能，改善自噬，清除受損的細胞器和代謝廢物，減少鐵和脂質過氧化物的積累，抑制小鼠心肌組織內鐵死亡的發(fā)生。本團隊當前的研究結果顯示，NMN能減輕AMI后心肌組織的鐵死亡，推測可能是通過升高體內NAD的水平，上調SIRT1的表達，修復溶酶體功能，從而提高AMI大鼠的線粒體自噬水平實現的。

本研究通過構建AMI大鼠模型，探討了NMN對AMI后心肌損傷的保護機制。本研究提供以下證據：（1）NMN可減輕AMI大鼠心肌組織的鐵死亡和炎癥反應，同時改善心臟功能；（2）NMN可提高AMI大鼠心肌組織SIRT1表達水平和線粒體自噬水平，減少心肌細胞鐵死亡的發(fā)生。本研究初步探索了NMN對

AMI后心臟保護作用的效果，但仍存在一些局限性，需要在未來的研究中加以改進。首先，本研究的樣本量相對較小，每組僅包含了10只大鼠。未來的研究中，增加樣本量將有助于增強研究結論的可信度和外推性。其次，本研究僅采用了SD大鼠作為實驗模型，無法全面代表所有可能受到影響的生物群體。此外，本研究中NMN的干預時間僅為兩周，這一短期干預可能不足以觀察到長期的生物學效應和潛在的慢性適應性變化。因此，未來的研究應考慮延長干預時間，以更好地理解NMN對心臟功能的長期影響及其可能的持續(xù)保護作用。最后，本研究主要在動物整體和組織器官水平探討了NMN對AMI后心肌細胞鐵死亡的抑制作用，但缺乏細胞和分子水平的深入驗證。未來研究需要通過細胞實驗和分子機制探討，進一步確認NMN抑制AMI大鼠鐵死亡的具體機制，揭示其潛在的治療價值。

綜上所述，大鼠AMI后，心肌細胞內線粒體自噬水平升高，但不能適應缺氧極端環(huán)境的變化，心肌細胞鐵死亡增加，補充NMN可上調SIRT1蛋白的表達，增強線粒體自噬功能，減輕心肌細胞鐵死亡，從而改善大鼠AMI后的心臟功能。本研究的結果將有助于更好地探索AMI治療的新靶點，同時也突顯了NMN在該領域潛在的臨床應用價值。

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