【摘要】 目的 明確C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族7成員（CLEC7A）在高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）中的作用及相應(yīng)的機(jī)制。方法 通過癌癥基因組圖譜-卵巢癌（TCGA-OV）數(shù)據(jù)集，結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與主調(diào)控因子分析（MRA），明確HGSOC中CLEC7A基因?qū)γ庖呦嚓P(guān)基因的作用；通過通路富集分析與驗證，確定了CLEC7A對酪氨酸激酶（JAK）/

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）通路的調(diào)節(jié)機(jī)制。分析GSE184880單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集，揭示了CLEC7A低表達(dá)與高表達(dá)的HGSOC中免疫細(xì)胞的比例和細(xì)胞通信的差異。收集2017年1月至2022年12月在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院/安徽省立醫(yī)院確診并行手術(shù)治療的70例HGSOC和70例卵巢透明細(xì)胞癌（OCCC）患者的石蠟?zāi)[瘤組織和對應(yīng)癌旁組織以及臨床病理資料，比較HGSOC與OCCC預(yù)后相關(guān)因素的差異；利用免疫組織化學(xué)染色法，檢測CLEC7A和PD-L1在HGSOC和OCCC及對應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)水平。構(gòu)建CLEC7A的短發(fā)夾RNA（shRNA）載體，檢測CLEC7A抑制后HGSOC細(xì)胞增殖和凋亡的變化。在CLEC7A高表達(dá)的小鼠腫瘤模型中，觀察髓系免疫抑制細(xì)胞（MDSC）、CD8+ T細(xì)胞的比例以及MDSC的功能變化。結(jié)果 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析顯示，叉頭框蛋白P3（FOXP3）與CLEC7A對免疫相關(guān)基因均起到調(diào)節(jié)作用，CLEC7A不僅與患者總體生存率相關(guān)，還在HGSOC腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)（均P lt; 0.05）。敲低CLEC7A后，不僅促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，還抑制了HGSOC細(xì)胞系的體內(nèi)外增殖（均P lt; 0.05）。CLEC7A通過JAK/STAT3信號通路調(diào)控程序性死亡配體-1（PD-L1）的表達(dá)。在CLEC7A高表達(dá)的腫瘤組織中，CD8+ T

細(xì)胞的比例下降，MDSC的比例上升，且MDSC的功能得到增強(qiáng)（均P lt; 0.05）。結(jié)論 HGSOC中CLEC7A誘導(dǎo)了PD-L1的表達(dá)，且促進(jìn)了HGSOC的增殖與免疫抑制信號通路的激活，可能導(dǎo)致HGSOC的惡性生長。

【關(guān)鍵詞】 C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族7成員； 高級別漿液性卵巢癌； 程序性死亡配體-1； JAK/STAT3通路； 腫瘤免疫

The role and mechanism of CLEC7A in regulating PD-L1 to promote ovarian cancer growth

CHEN Yao1， SUN Sibai2， XU Jun2 ， HE Jie1，2

（1. Qilu Medical College， Shandong University， Jinan 250012， China； 2. Clinical Pathology Center， the First Affiliated Hospital of University of Science and Technology of China， Anhui Provincial Hospital， Hefei 230001， China）

Corresponding author： XU Jun， E-mail： xujun_lab1@163.com； HE Jie， E-mail： hejie23@ustc.edu.cn

【Abstract】 Objective To elucidate the role of C-type lectin domain family 7 member A （CLEC7A） in high-grade serous ovarian carcinoma （HGSOC） and its underlying mechanisms. Methods Using the Cancer Genome Atlas-Ovarian Cancer （CGA-OV） dataset， combined with transcriptional regulatory network analysis and master regulator analysis （MRA）， the impact of CLEC7A on immune-related genes in HGSOC was determined. Pathway enrichment analysis and validation identified the regulatory mechanism of CLEC7A on the Janus Kinase （JAK）/signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） pathway. The GSE184880 single-cell sequencing dataset was analyzed to reveal differences in immune cell proportions and cellular communication between CLEC7A low-expression and high-expression HGSOC tumors. Paraffin-embedded tumor tissues and corresponding adjacent tissues， along with clinicopathological data， were collected from 70 HGSOC and 70 ovarian clear cell carcinoma （OCCC） patients diagnosed and surgically treated at the First Affiliated Hospital of the University of Science and Technology of China/Anhui Provincial Hospital between January 2017 and December 2022. Differences in prognostic factors between HGSOC and OCCC were compared. Immunohistochemical staining was used to detect the expression levels of CLEC7A and PD-L1 in HGSOC， OCCC， and corresponding adjacent tissues. A short hairpin RNA （shRNA） vector targeting CLEC7A was constructed to assess changes in the proliferation and apoptosis of HGSOC cells both after CLEC7A inhibition. In a mouse tumor model with high CLEC7A expression， the proportion of myeloid-derived suppressor cells （MDSCs） and CD8+ T cells， as well as the functional changes of MDSCs， were observed. Results Transcriptional regulatory network analysis revealed that forkhead box protein P3 （FOXP3） and CLEC7A both regulate immune-related genes. CLEC7A was not only correlated with overall patient survival but also highly expressed in HGSOC tumor tissues（all P lt;

0.05）. Knockdown of CLEC7A promoted apoptosis and inhibited the proliferation of HGSOC cell lines both in vitro and in vivo （all P lt; 0.05）. CLEC7A regulated the expression of programmed death ligand-1 （PD-L1） through the JAK/STAT3 signaling pathway. In CLEC7A high-expressing tumor tissues， the proportion of CD8+ T cells decreased， while the proportion of MDSCs increased， and the functionality of MDSCs was enhanced （all P lt; 0.05）. Conclusion CLEC7A induces PD-L1 expression in HGSOC， promotes HGSOC proliferation， and activates immunosuppressive signaling pathways， potentially leading to the malignant growth of HGSOC.

【Key words】 CLEC7A； High-grade serous ovarian carcinoma； PD-L1； JAK/STAT3 pathway； Tumor immunity

高級別漿液性癌（high-grade serous ovarian carcinoma，HGSOC）是卵巢癌中最常見且侵襲性最強(qiáng)的亞型，年發(fā)病率大約為（2～3）/100 000，5年病死率超過50%，占所有卵巢癌總數(shù)的70%［1］。由于其早期癥狀不明顯，約70%的患者在確診時已處于晚期，總體預(yù)后較差［2-5］。通過手術(shù)和化學(xué)治療等標(biāo)準(zhǔn)治療手段，HGSOC患者的5年生存率仍低于50%。近年來，免疫檢查點抑制劑如程序性死亡受體-1/程序性死亡配體-1（programmed death-1/programmed death ligand-1，PD-1/PD-L1）抑制劑在多種實體瘤中顯示出療效，但在HGSOC中的應(yīng)用效果有限［6-10］。研究表明，單獨使用PD-1/PD-L1抑制劑治療HGSOC的客觀緩解率僅約10%～15%。這種有限的療效可能與HGSOC的腫瘤微環(huán)境、PD-L1表達(dá)水平以及腫瘤突變負(fù)荷等因素有關(guān)。此外現(xiàn)有研究顯示，盡管聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑治療可以通過上調(diào)干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）增加PD-L1的表達(dá)，但患者對免疫治療的反應(yīng)性仍不理想，其機(jī)制有待進(jìn)一步的研究［4］。

CLEC7A主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，當(dāng)其與配體結(jié)合后，可通過內(nèi)含的免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）調(diào)節(jié)下游信號通路的激活［11-13］，然而，CLEC7A在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其與免疫治療之間的關(guān)聯(lián)尚未被報道。為此，本研究通過生物信息學(xué)方法分析CLEC7A在PD-1/PD-L1免疫調(diào)控中的作用，并以臨床標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）及體外細(xì)胞試驗等方式探討CLEC7A在HGSOC惡性生長中的作用及相應(yīng)機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

1.1.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

全部公共數(shù)據(jù)集分析使用R語言完成，使用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）biolinks軟件提取HGSOC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，計算與PD-1/PD-L1基因相關(guān)的基因，同時提取免疫相關(guān)基因，并用RTN軟件構(gòu)建基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，行主調(diào)控因子分析（master regulator analysis，MRA）算法對PD-1/PD-L1相關(guān)基因的調(diào)控能力進(jìn)行排序，再用RedeR軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.1.2 生存分析與信號通路分析

TCGA-卵巢癌（ovarian cancer，OV）數(shù)據(jù)集下載、標(biāo)準(zhǔn)化流程同上。用survival和survminer軟件計算CLEC7A、叉頭框蛋白P3（forkhead Box P3，F(xiàn)OXP3）的表達(dá)對總體生存率的影響。TCGA-OV 的RNA-seq數(shù)據(jù)在提取出HGSOC患者信息后，使用limma包計算得到CLEC7A高表達(dá)組中上調(diào)的基因后，使用clusterProfiler包計算上調(diào)的基因中信號通路的富集。

1.1.3 GSE184880數(shù)據(jù)集分析

GSE184880 scRNA測序數(shù)據(jù)包含4例對照組織與7例HGSOC組織，使用Seurat包讀取單細(xì)胞數(shù)據(jù)集，進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)集聚類，結(jié)合RunUMAP函數(shù)或RunTSNE函數(shù)進(jìn)行可視化，使用scType包對不同集群的細(xì)胞進(jìn)行注釋。CellChat包進(jìn)行細(xì)胞通信分析，評估CLEC7A表達(dá)分組對免疫細(xì)胞通信的影響。提取免疫細(xì)胞亞群并使用subset函數(shù)選擇對應(yīng)細(xì)胞，并使用DimPlot函數(shù)繪制CLEC7A高表達(dá)組和低表達(dá)組的t-SNE圖。

1.2 臨床病理特征及免疫組化檢測

1.2.1 病理樣本和臨床數(shù)據(jù)收集

選擇2017年1月至2022年12月在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院/安徽省立醫(yī)院確診并行手術(shù)治療的HGSOC患者和卵巢透明細(xì)胞癌（ovarian clear cell carcinoma，OCCC）病例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有明確的病理診斷結(jié)果；②患者臨床資料完整，能夠準(zhǔn)確評估病理分級與臨床預(yù)后分析。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無法評估原發(fā)病灶者；②術(shù)前接受過放射治療和（或）化學(xué)治療者。經(jīng)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后，設(shè)α為0.05，統(tǒng)計功效設(shè)為80%，總體標(biāo)準(zhǔn)差預(yù)設(shè)為10，具有統(tǒng)計學(xué)意義的δ差值設(shè)為5，從而估算出每組樣本量為63，為進(jìn)一步增強(qiáng)統(tǒng)計學(xué)效能，將樣本量定為70，并通過隨機(jī)抽樣最終確定樣本。最終納入70例HGSOC和70例OCCC石蠟?zāi)[瘤組織和對應(yīng)的癌旁組織，并收集患者相應(yīng)的臨床資料。本研究經(jīng)中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院/安徽省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會審批（批件號：2025-BLK-03），且所有入選患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2.2 高級別漿液性卵巢癌和卵巢透明細(xì)胞癌中CLEC7A和PD-L1表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色檢測

石蠟標(biāo)本均以10%中性甲醛固定，包埋后以4 μm厚連續(xù)切片，采用En Vision兩步法染色，分別加入一抗CLEC7A（美國Cell Signaling Technology公司）、二抗、3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。采用Autostainer Link 48 半自動免疫組化染色儀（美國Agilent公司）檢測PD-L1的表達(dá)，一抗PD-L1購自美國Agilent公司。

評價標(biāo)準(zhǔn)：CLEC7A陽性棕黃色主要定位于細(xì)胞核/漿，根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行半定量計分，0～2分為不表達(dá)，3～5分為低表達(dá)，6分及以上為高表達(dá)。PD-L1采用聯(lián)合陽性評分（Combined Positive Score，CPS），計算陽性活腫瘤細(xì)胞（任何強(qiáng)度的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色）及陽性淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞（任何強(qiáng)度的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色）占所有活腫瘤細(xì)胞的百分比，結(jié)果采用0～100表示。每次實驗均設(shè)置陰、陽性對照。

1.3 體外細(xì)胞實驗

1.3.1 細(xì)胞分組與培養(yǎng)

人HGSOC細(xì)胞系OVCAR-3購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心，細(xì)胞類別為傳代細(xì)胞，為第10代細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37 ℃恒溫、5%CO2的濕潤環(huán)境，采用DMEM并添加10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）。功能驗證實驗中，Scramble、CLEC7A shRNA載體均購自美國Sigma公司。OVCAR-3細(xì)胞分為對照組（CON）、敲減組（CLEC7A shRNA）組后，分別轉(zhuǎn)染Scramble、CLEC7A shRNA載體，每組重復(fù)3次取平均值，48 h后檢測各組CLEC7A在蛋白、mRNA水平的變化。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測CLEC7A的mRNA表達(dá)水平

實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）以TriZol裂解液（德國Sigma-Aldrich公司）取2×106個OVCAR-3細(xì)胞進(jìn)行裂解，依次加入氯仿和異丙醇進(jìn)行RNA分離和沉淀，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）反轉(zhuǎn)錄為模板DNA，SYBR染料法（日本TaKaRa公司）檢測mRNA水平的表達(dá)。以GAPDH基因為內(nèi)參，得到GAPDH與CLEC7A的Ct值后，使用2-??Ct法對CLEC7A基因的相對表達(dá)量進(jìn)行定量，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 蛋白免疫印跡法檢測CLEC7A及相關(guān)通路的蛋白表達(dá)

OVCAR-3細(xì)胞使用RIPA裂解液裂解后制樣電泳。一抗分別為GAPDH（美國Cell Signaling Technology公司）、CLEC7A（美國Abcam公司）、酪氨酸激酶（janus kinase，JAK，美國Cell Signaling Technology公司）、磷酸化（p）-JAK（美國Cell Signaling Technology公司）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3，美國Cell Signaling Technology公司）、p-STAT3（美國Cell Signaling Technology公司），以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行蛋白相對定量。

1.3.4 細(xì)胞增殖和凋亡實驗

細(xì)胞增殖實驗：采用CCK-8法（日本同仁化學(xué)研究所），在OVCAR-3細(xì)胞中，分別設(shè)置CON對照組和CLEC7A-shRNA組，感染48 h，加入1/10體積的CCK-8試劑，酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度。將各時間點的吸光度值與0 h的吸光度值相比，計算增殖指數(shù)。

細(xì)胞凋亡實驗：采用膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-別藻青蛋白（allophycocyanin，APC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染法（天津三箭生物公司），實驗流程按照說明書進(jìn)行。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，并將Annexin V APC陽性細(xì)胞定義為凋亡細(xì)胞。

JC-10染色法（美國ABP Biosciences公司）染色細(xì)胞，實驗流程按照說明書進(jìn)行。使用流式細(xì)胞儀檢測FL1通道、FL2通道，并將FL2陽性細(xì)胞定義為活細(xì)胞，F(xiàn)L2陰性細(xì)胞定義為凋亡細(xì)胞。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測PD-L1的表達(dá)

PD-L1流式細(xì)胞檢測抗體購自美國BD Biosciences公司，STAT3抑制劑Stattic購自美國Selleckchem公司。將OVCAR-3細(xì)胞分為CON組（對照組）和CLEC7A組（實驗組），并分別轉(zhuǎn)染CON（空載的EGFP-pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-3xFlag載體）與CLEC7A過表達(dá)載體（豐暉生物公司設(shè)計，骨架質(zhì)粒為EGFP-pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-3xFlag載體），轉(zhuǎn)染48 h。CLEC7A細(xì)胞用1.0×10-5 mol/L的Stattic處理24 h。消化細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，標(biāo)記PD-L1 PE抗體。使用流式細(xì)胞儀檢測CON組、CLEC7A組和CLEC7A+Stattic組細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 小鼠荷瘤實驗

小鼠荷瘤實驗流程由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：202407111005000167828）。

裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，均為雌性，6～8周齡，體質(zhì)量為18～22 g，分為CON組與CLEC7A shRNA組，每組5只。將OVCAR-3細(xì)胞分為CON組（對照組）和CLEC7A shRNA組（實驗組），同時將裸鼠分為CON組和CLEC7A shRNA組，每組5只，CON組每只小鼠注射1×107個CON組細(xì)胞，CLEC7A shRNA組小鼠每只小鼠注射1×107個CLEC7A shRNA組細(xì)胞，注射部位為右側(cè)背部皮下。注射21 d后，安樂死小鼠，計算2組小鼠原位腫瘤體積的大小，計算公式為V腫瘤= LW2/2，其中V為體積（單位為mm3），L為腫瘤的最長徑（單位為mm），W為垂直于最長徑的短徑（單位為mm）。

BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，BALB/c小鼠性別、周齡和體質(zhì)量的要求同裸鼠，將OVCAR-3細(xì)胞和BALB/c小鼠分為CON組和CLEC7A組（實驗組），每組各5只，CON組每只小鼠注射1×107個CON組細(xì)胞，CLEC7A組小鼠每只小鼠注射1×107個CLEC7A組細(xì)胞，注射部位為右側(cè)背部皮下。21 d后安樂死小鼠，收集原位腫瘤，并消化為單個細(xì)胞，一部分細(xì)胞標(biāo)記CD11b-FITC、Gr-1-PE，并將CD11b和Gr-1雙陽性細(xì)胞作為MDSC細(xì)胞，另一部分標(biāo)記CD3-PE-Cy7、CD4-APC-Cy7和CD8-APC（以上標(biāo)志物均購自美國BioLegend公司），并將CD3和CD8雙陽性且CD4陰性的細(xì)胞作為CD8+ T細(xì)胞，比較CON組和CLEC7A組之間MDSC以及CD8+ T細(xì)胞比例的差異。

選取BALB/c小鼠，得到小鼠脾臟單細(xì)胞懸液后，標(biāo)記CD3并流式分選得到T細(xì)胞，同時分離得到CON組和CLEC7A組移植瘤中的MDSC，將MDSC與T細(xì)胞混合，加入終濃度為2.5×10-6 mol/L

的羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE）染料（美國Thermo公司）。將染色后的細(xì)胞接種于含有抗CD28抗體的培養(yǎng)基中，72 h后，使用流式細(xì)胞儀檢測CFSE熒光強(qiáng)度。以未接受抗體刺激的細(xì)胞為對照，計算CD28 抗體刺激組（未混入MDSC）、CON組（CON組MDSC與T細(xì)胞混合）、CLEC7A組（CLEC7A組MDSC與T細(xì)胞混合）中增殖的T細(xì)胞比例，實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

使用R 4.3.3（2024-02-29 ucrt）。計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗均符合正態(tài)分布，以表示，兩組獨立樣本的比較使用t檢驗，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗，相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)性分析。生存分析使用單因素Cox分析。雙側(cè)P lt; 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析確定CLEC7A為高級別漿液性卵巢癌中與PD-1/PD-L1相關(guān)的基因

轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析顯示，HGSOC較其他卵巢癌亞型（如OCCC）具有更高的乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）突變頻率（圖1A）。HGSOC亞型相對于OCCC，也具有更高的PD-L1表達(dá)水平（圖1B）。HGSOC的5年生存率為25%，而OCCC的5年生存率則高達(dá)70%。HGSOC和OCCC患者的年齡分別為（56.12±12.45）歲和（55.69±11.64）歲，臨床分期分別為2.26±1.32和2.16±1.41，雌激素受體（estrogen receptor，ER）與孕激素受體（progesterone receptor，PR）之比（陽性為1，陰性為0）分別為0.38±0.13和0.52±0.24，Ki-67分別為（61.51±21.15）％和（26.16±23.64）％，是否復(fù)發(fā)（復(fù)發(fā)為1，不復(fù)發(fā)為0）分別為0.57±0.16和0.12±0.08，腫瘤體積分別為（3.12±1.23）cm3和（1.63±1.28）cm3。主要的差異在于BRCA1基因突變頻率與PD-L1表達(dá)水平。

進(jìn)一步通過分析TCGA-OV數(shù)據(jù)集，表明在PD-1/PD-L1相關(guān)基因中，F(xiàn)OXP3與CLEC7A對免疫相關(guān)基因具有調(diào)節(jié)能力（圖1C），MRA分析也表明了FOXP3與CLEC7A是具有調(diào)節(jié)能力的基因（圖1D）。CLEC7A高表達(dá)的患者總體生存率差于CLEC7A低表達(dá)的患者（圖1E），且CLEC7A在死亡的患者中表達(dá)升高（圖1G），而FOXP3與患者總體生存率并不相關(guān)（圖1F），且在生存與死亡的患者中表達(dá)無差異（圖1H）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也證實了高表達(dá)的CLEC7A主要集中在腫瘤細(xì)胞中，且高于鄰近的正常組織（圖1I）。

2.2 CLEC7A促進(jìn)高級別漿液性卵巢癌細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡

隨后構(gòu)建了具有CLEC7A敲低能力的CLEC7A shRNA（圖2A）。RT-qPCR結(jié)果顯示，CLEC7A shRNA

抑制CLEC7A mRNA水平的表達(dá)（圖2B）。敲低CLEC7A表達(dá)后，OVCAR-3細(xì)胞凋亡增加（圖2C）。JC-10染色證實，CLEC7A敲低使線粒體途徑的凋亡增加（圖2D）。CCK-8結(jié)果顯示，CLEC7A敲低后OVCAR-3的體外增殖能力下降（圖2E）。裸鼠荷瘤實驗顯示，CLEC7A敲低后，OVCAR-3的體內(nèi)增殖能力受限（圖2F）。

2.3 CLEC7A通過JAK/STAT3通路激活PD-L1表達(dá)

HGOSC細(xì)胞中CLEC7A隨著處理時間的延長而升高（圖3A）。在TCGA-OV數(shù)據(jù)集中，CLEC7A高表達(dá)組的高表達(dá)基因中，STAT3信號通路富集（圖3B、C）。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示CLEC7A敲低后，HGOSC細(xì)胞中JAK、STAT3蛋白磷酸化降低（圖3D）。進(jìn)一步構(gòu)建了CLEC7A過表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入OVCAR-3細(xì)胞系中，RT-PCR表明CLEC7A在mRNA水平上誘導(dǎo)了CLEC7A的表達(dá)（圖3E）。流式細(xì)胞結(jié)果顯示，CLEC7A的表達(dá)促進(jìn)了OVCAR-3細(xì)胞系表面PD-L1的表達(dá)，而使用STAT3抑制劑Stattic處理48 h后，OVCAR-3 CLEC7A細(xì)胞的PD-L1表達(dá)下降（圖3F）。CCK-8法結(jié)果顯示，CLEC7A過表達(dá)的HGOSC細(xì)胞增殖能力上升（圖3G）。免疫組化結(jié)果顯示CLEC7A與PD-L1在蛋白水平上存在關(guān)聯(lián)（圖3H）。

2.4 高級別漿液性卵巢癌中CLEC7A的高表達(dá)抑制T細(xì)胞的增殖

前面的數(shù)據(jù)揭示了CLEC7A對PD-L1體外的調(diào)節(jié)作用，通過單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集進(jìn)行體內(nèi)驗證，在GSE184880公共數(shù)據(jù)集中，CLEC7A高表達(dá)的HGSOC組織中，CD8+ T細(xì)胞的比例下降（圖4A）。在BALB/c小鼠的移植瘤中，CLEC7A過表達(dá)的腫瘤中MDSC的比例上升（圖4B），而CD8+ T細(xì)胞的比例下降（圖4C）。相對于從CON中分離得到的MDSC，CLEC7A過表達(dá)的移植瘤中的MDSC對T細(xì)胞增殖的抑制能力上升（圖4D）。

3 討 論

CLEC7A也稱為Dectin-1，是一種重要的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），在先天免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，其基本功能為識別真菌細(xì)胞壁成分中的β-1，3-葡聚糖，當(dāng)與β-1，3-葡聚糖結(jié)合后，通過其內(nèi)含的免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM），激活下游信號通路，包括Syk激酶和核因子-κB（nuclear factor -κB，NF-κB）通路，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥因子（如白介素-6、轉(zhuǎn)化生長因子-α）和趨化因子（如CXC基序趨化因子配體 8）的產(chǎn)生，增強(qiáng)吞噬作用，有效清除入侵的真菌病原體，此外，Dectin-1還參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，通過影響樹突狀細(xì)胞的成熟和抗原呈遞功能，調(diào)控T細(xì)胞的分化和功能，進(jìn)而在抗腫瘤免疫中發(fā)揮作用［14-18］。

近年的研究揭示，CLEC7A在多種腫瘤中表達(dá)異常，例如膠質(zhì)瘤中CLEC7A的高表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)［19-23］，在胃癌中，CLEC7A主要在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）上表達(dá)［24-26］，激活TAM中的NF-κB通路，促進(jìn)促炎因子和血管生成因子的釋放，增強(qiáng)腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，其高表達(dá)與T細(xì)胞免疫耐受、腫瘤的進(jìn)展和患者的不良預(yù)后相關(guān)［27］。本研究通過生物信息學(xué)以及體內(nèi)外研究，初步證實了CLEC7A通過免疫相關(guān)信號通路及PD-L1促進(jìn)HGSOC惡性生長的作用及初步的分子機(jī)制。

本研究首先選取了TCGA-OV數(shù)據(jù)集，并篩選出HGSOC亞型的測序數(shù)據(jù)，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示CLEC7A在PD-1/PD-L1相關(guān)基因中發(fā)揮了重要作用，調(diào)節(jié)了免疫基因的表達(dá)，并與患者的總體生存率密切相關(guān)。在病理標(biāo)本中，CLEC7A在HGSOC腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明，敲低CLEC7A不僅誘導(dǎo)了HGSOC細(xì)胞系的凋亡，還抑制了增殖，同時促進(jìn)了內(nèi)源性凋亡途徑的激活。此外，抑制腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)主要通過腫瘤細(xì)胞表面的Fas受體激活外源性凋亡途徑［28］，基于這些發(fā)現(xiàn)，筆者推測CLEC7A不僅通過直接調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來影響腫瘤的免疫環(huán)境，還通過內(nèi)在的細(xì)胞死亡途徑參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展。

根據(jù)現(xiàn)有研究報道，PARP抑制劑的重要治療靶點為BRCA1缺失性突變［29-30］，然而本研究數(shù)據(jù)顯示，PARP抑制劑能夠激活CLEC7A的表達(dá)，而CLEC7A的表達(dá)促進(jìn)的細(xì)胞增殖可能成為PARP抑制劑治療中的不利因素。通過通路富集分析與蛋白免疫印跡法，進(jìn)一步證實了CLEC7A能夠調(diào)節(jié)JAK和STAT3的磷酸化，而CLEC7A誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)增加依賴于STAT3通路的激活。因此，在PARP抑制劑作用的細(xì)胞中，CLEC7A及其下游的STAT3通路被激活，不僅誘導(dǎo)了PD-L1的表達(dá)，同時還促進(jìn)了細(xì)胞增殖，這成為CLEC7A調(diào)節(jié)疾病惡性生長的重要機(jī)制。

對scRNA測序數(shù)據(jù)集的分析和功能驗證結(jié)果顯示，在CLEC7A高表達(dá)的組織中，CD8+ T細(xì)胞的比例下降，而MDSC的比例上升，進(jìn)一步的T細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，在CLEC7A高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，MDSC的功能被激活，也確定了在接受PARP抑制劑處理的HGSOC細(xì)胞系中，盡管CLEC7A的高表達(dá)促進(jìn)了PD-L1的表達(dá)，但其誘導(dǎo)的免疫抑制信號能夠大幅削弱免疫治療的效果。

綜上所述，本研究明確了在HGSOC中，CLEC7A

的表達(dá)通過JAK/STAT3通路上調(diào)PD-L1的表達(dá)，同時，在體內(nèi)環(huán)境下，CLEC7A的高表達(dá)誘導(dǎo)了免疫抑制信號通路的激活，最終促進(jìn)了HGSOC的惡性生長，這一發(fā)現(xiàn)，為HGSOC免疫治療相關(guān)靶點的篩選提供理論和基礎(chǔ)研究依據(jù)，并為HGSOC藥物開發(fā)提供新的思路。

利益沖突聲明：本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。

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（責(zé)任編輯：林燕薇）