【摘要】 目的 探討胸腺素β4（Tβ4）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠單核-巨噬細(xì)胞RAW264. 7極化趨向，以及其對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。方法 用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞因子［腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）］的質(zhì)量濃度；Griess法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一氧化氮（NO）的分泌情況；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)核因子-κB（NF-κB）、環(huán)氧酶-2（COX-2）、

TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平；蛋白免疫印跡法檢測(cè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、NF-κB、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）、NF-κB抑制蛋白α（IκB-α）和磷酸化IκBα（p-IκB-α）蛋白水平；熒光染色雙標(biāo)法觀察巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)；免疫熒光染色檢測(cè)NF-κB定位及表達(dá)。結(jié)果 1 000 μg/L的胸腺素β4作用于RAW264.7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為90.2%，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。各質(zhì)量濃度的Tβ4均可有效抑制NO的產(chǎn)生（均P lt; 0.000 1）。

Tβ4降低 LPS誘導(dǎo)的炎癥模型 RAW264. 7細(xì)胞中促炎因子（TNF-α和IL-6）質(zhì)量濃度及NO濃度，下調(diào)NF-κB、COX-2、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平和iNOS、p-NF-κB和p-IκBα蛋白表達(dá)水平，抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)移，降低CD80的表達(dá)（均P lt; 0.05）。結(jié)論 Tβ4具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路和巨噬細(xì)胞M1極化有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 胸腺素β4；膿毒癥；巨噬細(xì)胞；感染；炎癥；NF-κB通路

The anti-inflammatory mechanism of thymosin β4 in a RAW 264.7 macrophage inflammation model

WU Tianyu1， LIN Yujun1， LIN Xiaoyu1， ZHU Yi1， YU Muxue1， LIU Wangkai1，2

（1.Department of Neonatology， the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China； 2. Department of Pediatrics， Guangdong Maternal and Child Health Hospital， Guangzhou 511400， China）

Corresponding author： LIU Wangkai， E-mail： liuwk@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】 Objective To explore the effects of Thymosin β4 （Tβ4） on the lipopolysaccharide （LPS）-induced polarization tendency of murine monocyte-macrophage RAW264.7 cells and its influence on inflammatory responses. Methods An inflammation model was established by LPS induction in RAW264.7 cells. Cell viability was assessed using the CCK-8 assay. The concentrations of cytokines ［tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6）］ were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Nitric oxide （NO） secretion in the cell culture supernatant was detected using the Griess method. Real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR） was employed to detect mRNA expression levels of nuclear factor-κB （NF-κB）， cyclooxygenase-2 （COX-2）， TNF-α， and IL-6. Western blotting was used to analyze protein levels of inducible nitric oxide synthase （iNOS）， NF-κB， phosphorylated NF-κB （p-NF-κB）， NF-κB inhibitor α （IκB-α）， and phosphorylated IκBα （p-IκB-α）. The polarization status of macrophages was observed using double fluorescence staining. Immunofluorescence staining was performed to examine NF-κB localization and expression. Results After treatment with 1 000 μg/L Tβ4 for 24 hours， the cell viability of RAW 264.7 cells was 90.2%， showing a statistically significant difference compared to the blank control group （P lt; 0.05）. Tβ4 at various concentrations effectively inhibited NO production （all P lt; 0.000 1）. Tβ4 decreased the concentrations of pro-inflammatory cytokines（TNF-α and IL-6） and NO in the LPS-induced RAW264.7 inflammatory model. It also downregulated mRNA expression of NF-κB， COX-2， TNF-α， and IL-6， as well as protein expression of iNOS， p-NF-κB， and p-IκBα. Additionally， Tβ4 inhibited NF-κB nuclear translocation and decreased CD80 expression （all P lt; 0.05）. Conclusion Tβ4 exhibits anti-inflammatory effects， the mechanisms of which may be associated with the inhibition of the NF-κB signaling pathway and suppression of macrophage M1 polarization.

【Key words】 Thymosin β4； Sepsis； Macrophages； Infection； Inflammation； NF-κB pathway

膿毒癥是由感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙［1］，是重癥患者最常見(jiàn)的死亡原因［2］。在膿毒癥中，機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)導(dǎo)致免疫細(xì)胞激活和大量炎癥介質(zhì)的釋放，這些炎癥介質(zhì)誘發(fā)了局部或全身性的炎癥反應(yīng)。若炎癥反應(yīng)進(jìn)一步惡化并導(dǎo)致免疫系統(tǒng)嚴(yán)重受抑，便可能引發(fā)膿毒癥，這表明機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)已經(jīng)失衡至無(wú)法自我調(diào)節(jié)的程度［3］。炎癥反應(yīng)是身體對(duì)感染或組織損傷的自然反應(yīng)，構(gòu)成了防御外來(lái)病原體的前線。膿毒癥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、免疫失調(diào)等復(fù)雜反應(yīng)［4］。巨噬細(xì)胞的持續(xù)性激活是推動(dòng)膿毒癥反應(yīng)進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一［5］。研究表明，巨噬細(xì)胞作為炎癥反應(yīng)的核心細(xì)胞，是固有免疫不可或缺的組成部分，在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［6］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為革蘭陰性細(xì)菌感染的生物標(biāo)志物［7］，其誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞是經(jīng)典的細(xì)胞炎癥模型，而RAW264.7細(xì)胞炎癥模型也是篩選抗炎藥物的經(jīng)典模型［8］。因此，抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)可為膿毒癥的治療提供新的思路，對(duì)其深入研究具有一定的價(jià)值。

胸腺素β4（thymosin β4，Tβ4）是一種小分子多肽，廣泛且保守地存在于哺乳動(dòng)物（除紅細(xì)胞外）的各類細(xì)胞中［9］。其不僅分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，還能作為內(nèi)分泌因子參與機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)有研究表明，Tβ4具有保護(hù)并修復(fù)心肌組織、促進(jìn)角膜修復(fù)和傷口愈合、誘導(dǎo)血管新生、參與神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)、促進(jìn)毛發(fā)的生長(zhǎng)以及減輕炎癥損傷等多種生物學(xué)功能［10］。此外研究表明，Tβ4可作用于核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號(hào)通路，從而改善肝纖維化［11］。然而，當(dāng)前對(duì)于Tβ4的抗炎作用機(jī)制的了解尚不全面。因此，本研究通過(guò)使用LPS激活RAW264.7細(xì)胞，構(gòu)建體外炎癥模型，探索Tβ4對(duì)于RAW264.7細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)及其在NF-κB信號(hào)通路中的作用，以期明確Tβ4的抗炎活性和相關(guān)機(jī)制，為T(mén)β4的深入研究和臨床應(yīng)用推廣提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，并為膿毒癥的臨床治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

包括Raw264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7，上海中喬新舟生物科技有限公司），Tβ4凍干粉劑（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司），大腸桿菌來(lái)源脂多糖LPS［西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］，CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司），一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司），白介素-6（interleukin-6， IL-6）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（欣博盛生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），ChamQ qPCR專用預(yù)混液試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），一抗IκBα、磷酸化IκBα（phospho-IκBα，p-IκBα）、NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性形式磷酸化NF-κB p65（phospho-NF-κB p65，p-NF-κB p65）［12］購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司，NF-κB p65（蛋白免疫印跡法）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，NF-κB p65（免疫熒光法）、CD80/B7-1抗體、CD86抗體均購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）置于10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液中傳代，在含5%CO2、37 °C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

1.3 RAW264.7細(xì)胞存活率的測(cè)定

采用CCK-8法：取傳代RAW264.7細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在37℃、5% CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

然后棄培養(yǎng)液，向每孔中加入100 μL含有不同質(zhì)量濃度Tβ4（0～1 000 μg/L）的細(xì)胞培養(yǎng)基，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔（后續(xù)相同），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后，向每孔中加入10 μL的增強(qiáng)型CCK-8溶液培養(yǎng)1 h。最后，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。細(xì)胞存活率為給藥組細(xì)胞OD值與對(duì)照組細(xì)胞OD值的百分比。

1.4 一氧化氮濃度的測(cè)定

采用Griess法：取一個(gè)無(wú)菌的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加入1 000 μL的細(xì)胞懸浮液（每毫升3×105個(gè)細(xì)胞）。培養(yǎng)24 h后，倒去培養(yǎng)液。然后，向每個(gè)孔中分別加入含有LPS（1 ng/L）和不同質(zhì)量濃度Tβ4（0、50、100、200、500 μg/L）的細(xì)胞培養(yǎng)液500 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集每孔中的上清液，使用NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)含量。

1.5 腫瘤壞死因子-α和白介素-6質(zhì)量濃度的測(cè)定

按“1.4”項(xiàng)的方法處理細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，棄上清液。Tβ4組添加含50 μg/L Tβ4和1 ng/L LPS的培養(yǎng)基，另設(shè)僅含1 μg/mL LPS的LPS組和使用空白培養(yǎng)基的空白組，培養(yǎng)24 h后，取細(xì)胞上清液，使用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定培養(yǎng)上清液中TNF-α及IL-6的含量。

1.6 RAW264.7細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的測(cè)定

按“1.4”項(xiàng)的方法處理細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測(cè)NF-κB、COX-2、TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平。收集細(xì)胞，提取總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA。各基因引物序列如表1所示。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算樣品中基因的相對(duì)含量。

1.7 蛋白表達(dá)水平的測(cè)定

采用蛋白免疫印跡法分析：按“1.4”項(xiàng)的方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，每孔加入RIPA充分裂解后，提取細(xì)胞蛋白并檢測(cè)蛋白含量。蛋白煮沸5 min后，電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜。室溫下，使用快速封閉液封閉30 min后，4℃一抗過(guò)夜孵育，清洗后加入相應(yīng)二抗孵育2 h。最后加入ECL發(fā)光。以GAPDH為內(nèi)參，使用ImageJ分析蛋白條帶灰度值，并計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 免疫熒光檢測(cè)

巨噬細(xì)胞可以極化成為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞［13］。在LPS的刺激下，巨噬細(xì)胞可發(fā)生M1型極化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，是炎癥性疾病的基礎(chǔ)［14］。CD80是M1型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記物［15］，通過(guò)免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)CD80的表達(dá)可觀察巨噬細(xì)胞向M1型極化的程度，從而反映巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)狀態(tài)。CD80表達(dá)降低則說(shuō)明巨噬細(xì)胞向M1型極化的效應(yīng)減輕，炎癥反應(yīng)得到抑制。細(xì)胞中NF-κB 二聚體的核轉(zhuǎn)移是調(diào)節(jié)基因表達(dá)程序和生物反應(yīng)的基礎(chǔ)［16］，核轉(zhuǎn)移減少可說(shuō)明NF-κB通路得到抑制，炎癥反應(yīng)減輕。按“1.4”項(xiàng)的方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，用4%的多聚甲醛固定，封閉液處理30 min，4 ℃一抗孵育過(guò)夜（NF-κB稀釋比例為1∶100，CD80稀釋比例為1∶200，CD86

稀釋比例為1∶100）。次日清洗后加入相應(yīng)熒光二抗（稀釋比例為1∶500），濕盒中37 ℃孵育

1 h，清洗后滴加DAPI避光孵育5 min染核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。在細(xì)胞核轉(zhuǎn)移分析中，獲取圖像后，用ImageJ軟件分析，統(tǒng)計(jì)出每個(gè)視野的DAPI數(shù)量和NF-κB入核數(shù)量（核轉(zhuǎn)移率為入核細(xì)胞數(shù)量與DAPI數(shù)量的百分比）。針對(duì)CD80表達(dá)的檢測(cè)，獲取圖像后，用ImageJ軟件分析，平均熒光強(qiáng)度等于所求區(qū)域熒光強(qiáng)度總和與區(qū)域面積熒光強(qiáng)度的比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism 9.4.0進(jìn)行分析與繪圖。所有數(shù)據(jù)均以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett檢驗(yàn)、Tukey

檢驗(yàn)。雙側(cè)P lt; 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胸腺素β4對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

CCK-8法檢測(cè)Tβ4對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，當(dāng)RAW264.7細(xì)胞分別經(jīng)50、100、200、500 μg/L的Tβ4處理24 h后，各處理組的細(xì)胞存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P gt; 0.05）。1 000 μg/L的胸腺素β4作用于RAW264.7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為90.2%，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 胸腺素β4降低脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中一氧化氮的生成

各質(zhì)量濃度的Tβ4均可有效抑制NO的產(chǎn)生（均P lt; 0.000 1）。見(jiàn)表3。

2.3 胸腺素β4減少脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌及表達(dá)

RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS處理24 h后，培養(yǎng)上清液中的TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度相較于空白組增加（均P lt; 0.000 1）。與LPS處理組相比，50 μg/L的Tβ4處理降低了RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-6的分泌（均P lt; 0.01）。RT-qPCR測(cè)定RAW264.7細(xì)胞中COX-2、IL-6、TNF-α、NF-κB的表達(dá)水平結(jié)果顯示，Tβ4處理降低了LPS誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞COX-2、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA表達(dá)水平（均P lt; 0.01）。見(jiàn)圖1。

2.4 脂多糖誘導(dǎo)的RAW264. 7細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白及核因子-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化

與Control組相比，LPS組p-IκB-α、iNOS、p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平較高（均P lt; 0.001）。與LPS組相比，Tβ4組p-IκB-α、iNOS、p-NF-κB p65的表達(dá)水平低于LPS組（均P lt; 0.01）。見(jiàn)圖2。

2.5 胸腺素β4對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的 RAW264. 7細(xì)胞核因子-κB活化及M1極化的影響

與Control組相比，LPS組NF-κB核轉(zhuǎn)移增多；與LPS組相比，Tβ4組NF-κB核轉(zhuǎn)移減少（均P lt; 0.001），見(jiàn)圖3。與Control組相比，LPS組CD80表達(dá)升高；與LPS組相比，Tβ4組CD80表達(dá)降低（均P lt; 0.01），見(jiàn)圖4。

3 討 論

膿毒癥是包括外傷在內(nèi)的嚴(yán)重感染、燒傷及術(shù)后常見(jiàn)并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為機(jī)體炎癥細(xì)胞的大量活化，構(gòu)成炎癥因子風(fēng)暴，引起多器官功能衰竭而致死［17］。炎癥是機(jī)體組織受損（如各種炎癥因子）時(shí)發(fā)生的一系列保護(hù)性反應(yīng)［18］。炎癥反應(yīng)對(duì)于抵抗細(xì)菌和病毒感染至關(guān)重要，但如果炎癥反應(yīng)持續(xù)或過(guò)度，可能會(huì)引發(fā)一系列病理生理變化，從而增加多種疾病如糖尿病、支氣管哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在極端情況下，過(guò)度的炎癥反應(yīng)甚至可能導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征，這是一種可能危及生命的嚴(yán)重狀況［19］。因此，開(kāi)發(fā)安全、有效的抗炎藥物是一項(xiàng)長(zhǎng)期且重要的科研任務(wù)。

巨噬細(xì)胞是一類關(guān)鍵的免疫細(xì)胞，它們?cè)诰S持組織穩(wěn)態(tài)、炎癥反應(yīng)和疾病進(jìn)展中扮演著至關(guān)重要的角色［20］。炎癥的啟動(dòng)和消退受到巨噬細(xì)胞調(diào)控。巨噬細(xì)胞可極化成為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞。當(dāng)巨噬細(xì)胞極化成M1型時(shí)可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而M2型極化可以抑制機(jī)體過(guò)度炎癥反應(yīng)。M1型巨噬細(xì)胞是促炎細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α 的主要來(lái)源［21］，是導(dǎo)致多數(shù)炎癥性疾病的基礎(chǔ)［22］。巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，能夠識(shí)別病原體相關(guān)的分子模式，如LPS。LPS通過(guò)細(xì)胞表面表達(dá)的toll 樣受體（toll-like receptor， TLR）激活巨噬細(xì)胞［23］。TLR4作為一種廣泛存在于多種組織細(xì)胞（包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）中的受體，能夠直接識(shí)別LPS，并通過(guò)NF-κB信號(hào)通路激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程［24］。NF-κB在調(diào)控促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用。在靜息狀態(tài)下，NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它在細(xì)胞內(nèi)與抑制因子IκB-α結(jié)合，以非活化狀態(tài)存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)，IκB激酶（inhibitor of κB kinase，IκK）被激活，特別是IκKβ的活化，導(dǎo)致IκB-α的N端調(diào)節(jié)區(qū)的Ser32/36位點(diǎn)磷酸化。這一磷酸化過(guò)程觸發(fā)IκB-α的泛素化和隨后的降解，從而釋放NF-κB p65亞基。釋放的NF-κB p65亞基隨后進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因的κB序列結(jié)合，促進(jìn)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括TNF-α、IL-6以及誘導(dǎo)型NO合酶，后者產(chǎn)生NO；這些基因的激活和表達(dá)在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和炎癥過(guò)程的進(jìn)展［25］。RAW264. 7細(xì)胞是一種常用于炎癥研究的巨噬細(xì)胞模型。受炎癥刺激時(shí)，RAW264.7細(xì)胞能夠分化為促炎性的M1型，并分泌大量促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6等［26］。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，可以活化巨噬細(xì)胞。在LPS的刺激下，巨噬細(xì)胞會(huì)極化為M1型并分泌炎癥因子形成強(qiáng)烈的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其生物標(biāo)志物主要有TNF-α、IL-6、COX-2、NO、iNOS等［27］。NO作為一種重要的炎癥信使，其過(guò)度生成并與超氧自由基反應(yīng)形成過(guò)氧亞硝酸鹽，與炎癥性疾病的進(jìn)展密不可分［28］。TNF-α是一種關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)，它能夠激發(fā)其他免疫因子的產(chǎn)生，并促進(jìn)NO的合成，在炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色。IL-6作為一種典型的炎癥介質(zhì)，它在感染、組織損傷和炎癥過(guò)程中被產(chǎn)生和釋放，參與調(diào)節(jié)多種炎癥反應(yīng)，包括發(fā)熱、疼痛、紅腫以及局部白細(xì)胞的遷移。此外，IL-6有時(shí)與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)，其信號(hào)傳導(dǎo)能夠激活NF-κB通路［25］。TNF-α和IL-6的釋放水平可以作為衡量炎癥水平的間接指標(biāo)。CD80作為M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)其表達(dá)水平可以評(píng)估巨噬細(xì)胞向M1型分化的程度，從而反映炎癥狀態(tài)。NF-κB二聚體向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移對(duì)于調(diào)控基因表達(dá)程序和生物反應(yīng)至關(guān)重要，核內(nèi)轉(zhuǎn)移的減少表明NF-κB信號(hào)通路受到抑制，炎癥反應(yīng)得到減輕。

Tβ4具有減輕炎癥損傷的功能，本研究旨在探究其抗炎機(jī)制：首先，采用不同質(zhì)量濃度Tβ4刺激 RAW264. 7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Tβ4質(zhì)量濃度在50～

500 μg/L時(shí)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響；質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 μg/L后，細(xì)胞活力下降，提示其安全劑量范圍應(yīng)小于500 μg/L。NO參與多種生理和病理過(guò)程。過(guò)量的NO會(huì)促進(jìn)炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展，而細(xì)胞中TNF-α、IL-6作為炎癥因子，其分泌量可間接反映炎癥程度［29］。本研究使用Griess法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的分泌情況。當(dāng)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，NO分泌量明顯升高；而與LPS組相比，各質(zhì)量濃度Tβ4均有效抑制NO的產(chǎn)生。在炎癥因子的表達(dá)方面，酶聯(lián)免疫吸附法結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌的IL-6和TNF-α明顯增多，這與劉芬等［30］的研究結(jié)果相符，他們發(fā)現(xiàn)LPS能夠顯著增加炎癥因子的表達(dá)；而Tβ4的干預(yù)則降低了促炎因子的水平，提示經(jīng)過(guò)Tβ4處理后，細(xì)胞模型的炎癥程度減輕［31］。同時(shí)，本研究還顯示Tβ4抑制了LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中p-NF-κB和pIκB-α、INOS蛋白水平的表達(dá)，表明Tβ4可通過(guò)抑制IκB-α和NF-κB P65的磷酸化來(lái)調(diào)控 NF-κB 通路起到抑制炎癥的作用。此外，本研究還觀察到Tβ4降低了TNF-α、NF-κB、COX-2、TNF-α和IL-6等炎癥基因的mRNA表達(dá)水平，這進(jìn)一步證實(shí)了Tβ4的抗炎作用。此外，本研究還通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)了巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)及NF-κB核轉(zhuǎn)移，并觀察了LPS刺激和Tβ4處理對(duì)這些過(guò)程的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS顯著促進(jìn)了NF-κB的核轉(zhuǎn)移及M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD80的表達(dá)，這與Liu等［32］、李夢(mèng)等［33］的研究結(jié)果一致，前者發(fā)現(xiàn)LPS能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化，后者發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD80的表達(dá)增加。Tβ4處理降低了CD80的表達(dá)，并減少了NF-κB的核轉(zhuǎn)移。免疫熒光結(jié)果表明，在Tβ4的作用下，巨噬細(xì)胞向M1型極化得到了抑制，炎癥反應(yīng)得以減輕；同時(shí)，Tβ4可以減少巨噬細(xì)胞NF-κB的核轉(zhuǎn)移，抑制了NF-κB信號(hào)通路的效應(yīng)。上述結(jié)果提示Tβ4具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，同時(shí)與其抑制巨噬細(xì)胞的M1極化有關(guān)。

綜上所述，Tβ4顯示出對(duì)炎癥損傷的一定治療潛力，其作用機(jī)制可能涉及抑制NF-κB信號(hào)通路以及巨噬細(xì)胞的極化，從而發(fā)揮抗炎效果。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于開(kāi)發(fā)新的抗炎藥物具有重要意義，特別是在治療由巨噬細(xì)胞極化失衡引起的膿毒癥方面。然而，Tβ4與NF-κB之間的直接相互作用及其在巨噬細(xì)胞極化中的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究來(lái)闡明。

利益沖突聲明：本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：林燕薇）